鋱摻雜碳點的制備及其抑菌性能

李 宏，田 浩，于麗娟，高 哲，楊亞玲，李晚誼，*

(1.云南省農業(yè)科學院 農產品加工研究所，云南 昆明 650221； 2.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500)

隨著城市化和工業(yè)化的發(fā)展，許多環(huán)境污染物，如有機染料和工業(yè)廢水中的微生物被注入水源[1]，從而可能導致一些傳染病的流行，威脅人類健康[2]。大腸埃希菌是微生物中的重要菌群，人體感染后可引起急性腹瀉、嘔吐、敗血癥等。因此，開發(fā)適用于處理大腸埃希菌污染的有效技術已成為亟待解決的問題。近年來，碳點光催化技術在解決此類問題上越發(fā)展現(xiàn)出其潛力：Venkateswarlu等[3]研發(fā)的用真菌衍生的光致發(fā)光碳點，對大腸埃希菌具有有效的光誘導殺菌活性；Das等[4]研發(fā)的用鋅和氮摻雜的藍綠色發(fā)光碳點，在光照條件下對大腸埃希菌同樣顯示出有效的光催化抑菌效果。

碳點(CDs)，是一種尺寸小于10 nm的碳納米材料[5]，因具有低毒性、光學穩(wěn)定性、環(huán)境友好性、生物相容性、高耐光漂白性等優(yōu)點，近年來受到了廣泛的關注[6-7]。通常，碳點表面富含羥基、羧基和胺基等官能團[8]，使其具有單分散性強、溶解度高等特點。由于其自身的良好性質，碳點已廣泛應用于生物成像[9-10]、藥物輸送[11]、光電和能量裝置[12]、熒光油墨[13]、光催化[14-16]和傳感器等領域[17]。碳點可以通過自上而下(激光燒蝕、化學氣相沉積等)和自下而上(水熱、電沉積、溶劑熱等)的方法合成，主要來自化學和綠色資源的各種前體[18-19]。

本研究以馬鈴薯為碳源，通過一步水熱法合成碳點[4]，再將鋱與碳點在室溫下攪拌，最終制備成鋱摻雜的碳點。所合成的碳點富含羥基、羧基等，容易進行后續(xù)的改性和應用。此外，還探索了鋱摻雜的碳點在光催化條件下對大腸埃希菌的抑制作用，及其對大腸埃希菌進行熒光標記的可行性[20-21]，旨在為進一步利用碳點開展微生物抑菌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

蛋白胨、酵母粉、瓊脂、葡萄糖，生物試劑，北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；三氯化鋱六水合物，上海麥克林生化科技有限公司；馬鈴薯，購于當地超市。

1.2 儀器

UV-2550型紫外可見分光光度計(日本，島津公司)，TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀(德國，BRUKER公司)，G9800A型熒光分光光度計(美國，安捷倫公司)，TecnaiG2TF30型場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)(荷蘭，F(xiàn)EI公司)，THZ-100型恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學儀器有限公司)，VS-1300型潔凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，Thermo Scientific 3913型恒溫培養(yǎng)箱(美國，Thermo Scientific公司)，YXQ-LS-75G型滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)，120 mL聚四氟乙烯內襯水熱反應釜(上海一凱儀器設備有限公司)，F(xiàn)A1004型電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)，S-4800 FE型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)(日本，Hitachi公司)，TCS-SP5型共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)(德國，Leica公司)。

1.3 供試菌種

選用的菌種為大腸埃希菌(Escherichiacoli)，系革蘭氏陰性致病菌。

1.4 鋱摻雜碳點(Tb-CDs)的制備

稱取馬鈴薯干粉3 g，加入100 mL去離子水中，將得到的懸浮液加入到120 mL聚四氟乙烯內襯水熱反應釜的內襯中，將其放入馬弗爐中在180 ℃條件下加熱6 h，自然冷卻至室溫后，將得到的溶液以8 000 r·min-1的轉速離心10 min以去除不溶于水的大顆粒物質，再用0.22 μm的濾膜過濾掉大分子物質。最后，將得到的溶液在60 ℃真空干燥箱中干燥，得到CDs固體粉末。

將三氯化鋱配制成濃度0.1 mol·mL-1的溶液。稱取0.2 g的CDs固體粉末溶于20 mL去離子水中制備CDs溶液，將制備的CDs溶液和5 mL的三氯化鋱溶液加入三頸燒瓶中，在室溫下磁力攪拌5 h，所得到的溶液即為Tb-CDs溶液，置于60 ℃真空干燥箱干燥，得到Tb-CDs固體粉末。

1.5 抑菌實驗

1.5.1 菌體活化與菌液制備

將冷凍保存的大腸埃希菌菌種與5 mL菌種所需的液體培養(yǎng)基進行混合，于37 ℃、200 r·min-1的條件下在搖床上培養(yǎng)12 h。血球計數板計數菌液濃度(控制大腸埃希菌的菌液濃度為1×106CFU·mL-1)。

1.5.2 抑菌材料的光催化抑菌實驗

將Tb-CDs、CDs分別加入含有5 mL菌液的石英試管中混合均勻，Tb-CDs的質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1，CDs的質量濃度為0.6 mg·mL-1。隨后，將樣品溶液置于可見光下照射不同的時間間隔，判斷抑菌劑的抑菌效果。在無光照條件下重復相同的實驗步驟。此外，在相同條件下開展不加Tb-CDs、CDs的空白實驗(CK)

1.5.3 稀釋平板計數法計算Tb-CDs對大腸埃希菌的抑菌率

在超凈工作臺上，將LB培養(yǎng)基(121 ℃滅菌20 min)傾斜倒入培養(yǎng)基平板上，待其凝固。將100 μL含有碳點的菌液加到已凝固的培養(yǎng)基平板上，再用涂布器快速將其均勻涂布，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。每組實驗均做3個平行。用平板計數法計算每個平板菌落的數量。計算每組實驗中3個平行實驗的菌落數平均值，作為該組實驗的最終菌落數。計算Tb-CDs對大腸埃希菌的抑菌率。

1.6 Tb-CDs對大腸埃希菌的熒光標記

將大腸埃希菌在LB培養(yǎng)基中孵育。大腸埃希菌菌懸液與Tb-CDs在37 ℃無光振蕩培養(yǎng)2 h，4 000 r·min-1離心收集大腸埃希菌菌體。然后，用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌大腸埃希菌菌體，4 000 r·min-1離心6次以除去未進入細菌細胞的培養(yǎng)基和Tb-CDs，分別在405、488、555 nm激發(fā)波長的CLSM上進行熒光成像。

2 結果與分析

2.1 Tb-CDs的透射掃描電鏡、紅外、紫外、熒光光譜

由紫外吸收光譜(圖2)可知，Tb-CDs的紫外吸收范圍較寬，在300 nm和375 nm處有最大吸收峰，分別是Tb-CDs SP2區(qū)域的π-π*、n-π*躍遷[24-25]。

如圖3-a所示，Tb-CDs的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長分別是360、442 nm，即在激發(fā)波長為360 nm時，該碳點的最大發(fā)射波長為442 nm。在自然光下，Tb-CDs溶液呈淡黃色；在紫外燈照射下，Tb-CDs溶液呈現(xiàn)明亮的藍色熒光。圖3-b為Tb-CDs在不同激發(fā)波長下的發(fā)射波長，可以看出，Tb-CDs在激發(fā)波長為360 nm處有最大發(fā)射波長。

2.2 Tb-CDs和CDs對大腸埃希菌的光催化抑菌效果

探究Tb-CDs(0.6 mg·mL-1)分別在無光和光照條件下對大腸埃希菌的抑菌效果。如圖4-a所示，Tb-CDs對大腸埃希菌的抑菌作用在無光條件下不明顯，光照40 min時抑菌作用明顯。圖4-b為大腸埃希菌在Tb-CDs無光和光照(40 min)處理下活菌數的對數值，結果顯示，Tb-CDs在可見光照射下能將大腸埃希菌殺死，有較強的抑菌效果。

圖1 Tb-CDs的TEM圖像(a)和紅外光譜圖(b)Fig.1 Transmission electron microscope image (a) and Fourier transform infrared spectrum (b) of Tb-CDs

圖2 Tb-CDs的紫外光譜Fig.2 Ultraviolet-vis absorption spectrum of Tb-CDs

將Tb-CDs和CDs對大腸埃希菌的抑菌效果進行對比。如圖5所示，在相同質量濃度下(0.6 mg·mL-1)，CDs對大腸埃希菌的抑制作用隨著光照時間延長沒有明顯變化，抑菌效果不明顯；而Tb-CDs對大腸埃希菌的抑制作用隨著光照時間的延長顯著增強。當光照時間為60 min時，Tb-CDs對大腸埃希菌的抑菌率達到了100%，明顯大于CDs對大腸埃希菌的抑菌率。

2.3 不同質量濃度Tb-CDs對大腸埃希菌的光催化抑菌效果

探究Tb-CDs在不同質量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1)下對大腸埃希菌的抑菌效果。如圖6所示，Tb-CDs對大腸埃希菌的抑菌率隨著碳點質量濃度的增加而增大，當碳點的質量濃度達到0.6 mg·mL-1時，其對大腸埃希菌的抑菌率最大；之后，進一步增加Tb-CDs的質量濃度時，其對大腸埃希菌的抑菌率沒有明顯變化。

圖3 Tb-CDs的熒光光譜(a)和光致發(fā)光發(fā)射光譜(激發(fā)波長為310～400 nm)(b)Fig.3 Fluorescent spectra (a) and photoluminescent emission spectra (excitation wavelength of 310-400 nm) (b) of Tb-CDs

圖4 大腸埃希菌在Tb-CDs無光和光照(40 min)處理下菌落的生長情況(a)及其活菌數量(b)Fig.4 Growth (a) and bacterial quantity (b) of E. coli under dark and light (irradiation of 40 min) enviroment with Tb-CDs

圖5 大腸埃希菌在CDs(a)和Tb-CDs(b)處理下菌落的生長情況及其細胞數量變化(c)，和Tb-CDs與CDs對大腸埃希菌的抑菌率(d)Fig.5 Colony growth of E. coli treated with CDs (a) or Tb-CDs (b) and changes of bacterial quantity (c)， and antibacterial rate of CDs or Tb-CDs against E. coli(d)

圖6 不同質量濃度的Tb-CDs對大腸埃希菌菌落生長(光照60 min)的影響(a)及其對大腸埃希菌抑菌率的動態(tài)變化(b)Fig.6 Colony growth of E.coli under different concentrations of Tb-CDs (irradiation of 60 min) (a) and dynamics of antibacterial rate of different concentrations of Tb-CDs against E.coli(b)

2.4 Tb-CDs對大腸埃希菌的光催化抑菌機制分析

Tb-CDs對大腸埃希菌的光催化抑菌作用歸因于活性氧(ROS)的影響，如羥基自由基(HO·)、超氧離子(O2·-)、空穴(h+)等[16，26-27]。如圖7所示，在可見光照射下，電子從Tb-CDs的價帶轉移至導帶，從而形成e--h+對。游離的e-可與O2反應生成O2·-，而h+則與—OH結合產生HO·。該反應過程中產生的光生e-、h+和自由基可破壞細胞包膜的完整性，并導致其死亡。

圖7 在可見光照射下Tb-CDs光催化滅活大腸埃希菌的示意圖Fig.7 Schematic of photocatalytic inactivation of E. coli by Tb-CDs under visible-light irradiation

通過SEM觀察微生物表面的形狀變化[28]。圖8-a顯示了光催化抑菌前大腸埃希菌的SEM圖像，從中可以觀察到保存完好的細胞壁。如圖8-b、c所示，在光催化條件下，Tb-CDs加入后，大腸埃希菌的細胞壁開始起皺收縮，細胞壁變形，在細胞壁表面出現(xiàn)多處小的凹坑和突出點，照射結束時，幾乎整個細胞表面都被孔隙占據，導致細菌細胞完全扭曲。這表明，在光催化抑菌過程中，Tb-CDs與大腸埃希菌的細胞壁有多個相互作用位點，從而導致細胞壁的破壞。其破壞機理可能是，在抑菌過程中，Tb-CDs與大腸埃希菌細胞相互接觸，并在光照條件下產生自由基，自由基作用于細胞的磷脂層，細胞被破壞，進而誘發(fā)細胞膜滲透性的改變[29]，細胞外的物質進入細胞，導致細胞失活，最終引發(fā)細胞死亡。

2.5 Tb-CDs對大腸埃希菌的熒光標記

Tb-CDs具有優(yōu)異的熒光性能和良好的生物相容性，因此可以作為熒光探針來對大腸埃希菌進行熒光標記。Tb-CDs的尺寸小，大腸埃希菌能很好地攝取Tb-CDs。本研究利用CLSM驗證了Tb-CDs對大腸埃希菌的標記。大腸埃希菌在與Tb-CDs孵育2 h后，表現(xiàn)出強烈的熒光。如圖9所示，將其分別在405、488、555 nm波長下激發(fā)時，可分別觀察到藍、綠、紅等多色熒光，說明利用Tb-CDs可以對大腸埃希菌進行熒光標記。

圖8 大腸埃希菌(a)及與Tb-CDs在光照下共存40 min(b)的SEM圖像Fig.8 Scanning electron microscope image of E.coli(a) and E.coli treated with Tb-CDs (b, c) under irradiation of 40 min

圖9 Tb-CDs標記的大腸埃希菌的熒光圖像Fig.9 Fluorescent images of E. coli labeled with Tb-CDs

3 結論

以馬鈴薯為原料，通過一步水熱法合成了CDs，再將稀有金屬鋱與CDs通過室溫攪拌，混合后合成了Tb-CDs。通過透射掃描電鏡、紫外光譜、紅外光譜、熒光光譜等對Tb-CDs的形態(tài)結構進行表征，并以革蘭氏陰性菌——大腸埃希菌為模型，研究了Tb-CDs的光催化抑菌性能。結果顯示，在光照條件下，Tb-CDs能有效地抑制大腸埃希菌的生長，并顯示出良好的抑菌效果。此外，Tb-CDs還可以對大腸埃希菌進行熒光標記，在不同激發(fā)波長下顯示出不同顏色的熒光。本研究不僅拓寬了碳點的制備方法，而且也為碳點的功能化和生物應用奠定了基礎。