四種屬魚類線粒體Cyt b基因的序列變異及系統(tǒng)發(fā)育研究

袁冬皓，楊天燕，*，孟 瑋，鄭 瑤，鄭德育

(1.浙江海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022； 2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所， 浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點漁場漁業(yè)資源科學(xué)觀測實驗站， 浙江 舟山316021)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是生物體唯一分布在細胞核外遺傳物質(zhì)，與核DNA有不同的演化起源。由于缺乏遺傳重組、群體內(nèi)變異大、具有較高的突變速率等特點，廣泛應(yīng)用于物種起源、系統(tǒng)進化及遺傳背景等領(lǐng)域的研究[8-9]。細胞色素b(cytochromeb，Cytb)基因是目前線粒體基因組中結(jié)構(gòu)和功能研究得最為清楚的蛋白編碼功能基因之一。由于其在進化過程中序列變異率相對較高，種間差異較大，且進化速度適中，易用一些通用引物擴增和測序，尤其在物種的個體識別、親緣關(guān)系鑒定和種群遺傳關(guān)系等研究領(lǐng)域具有較大優(yōu)勢[10-11]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取和PCR擴增

取樣品肌肉100 mg左右，采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取基因組DNA[12]，紫外分光光度計檢測濃度后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。用于擴增Cytb基因片段的引物序列為L14734(5＇-AACCACCGTTGTTATTCAACT-3＇)和CYTB(5＇-CTCAGAATGACATTTGTCCTCA-3＇)[13]。PCR擴增在美國伯樂PCR擴增儀(Bio-Rad T100)上進行，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)總體積25 μL，其中包含10×Buffer 2.5 μL，dNTP(25 mmol·L-1)2 μL，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，全式金TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL及DNA模板(50 ng)1 μL，去離子水補至25 μL。取2 μL PCR產(chǎn)物與等量的6×DNA Loading buffer混合均勻，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離約20 min后，紫外燈觀察并拍照記錄。選取條帶明亮的擴增產(chǎn)物送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

使用DNASTAR. Lasergene-v7.1軟件包[14]截取有效序列片段并進行比對；Dnasp5.0軟件[15]檢測多態(tài)位點和簡約信息位點數(shù)，計算單倍型數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性；MEGA6.0軟件[16]統(tǒng)計堿基組成、堿基替換數(shù)，并基于Kimura雙參數(shù)模型計算種內(nèi)和種間遺傳距離；DAMBE軟件[17]進行堿基替代飽和度檢驗；使用Modeltest 3.7軟件[18]對同源序列核苷酸替換最適模型進行篩選，并在此基礎(chǔ)上使用PAUP4.0軟件[19]中最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列差異比較

圖1 四種屬魚類Cyt b基因片段序列變異位點Fig.1 Nucleotide variation sites of partial Cyt b gene sequences in four Sillago species

表1 四種屬魚類Cyt b基因片段序列的堿基組成頻率Table 1 Base frequency compositions of Cyt b gene fragments in four Sillago species %

2.2 遺傳多樣性分析

2.3 遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MEGA6軟件，基于Kimura 2模型計算得到4種屬魚類的種內(nèi)不同個體間平均遺傳距離分別為斑0.006，亞洲0.007，少鱗0.012，多鱗0.193。不同種間凈遺傳距離如表3所示，結(jié)果顯示，斑和亞洲、少鱗間的凈遺傳距離最大，分別為0.280和0.256；斑與多鱗的凈遺傳距離最小，為0.157。

使用DAMBE軟件進行序列堿基替換飽和度檢驗，得出ISS

表2 四種屬魚類Cyt b基因片段遺傳多樣性分析Table 2 Genetic diversity of Cyt b gene fragments in four Sillago species

表3 基于Cyt b基因序列的4種屬魚類種間平均凈遺傳距離Table 3 Average net genetic distances among four Sillago species based on Cyt b gene

以隸屬于鱸形目Perciformes、天竺鯛科Apogonidae、天竺鯛屬Apogon的斑紋天竺鯛Apogonmaculatus(GenBank登錄號：MG957647)作為外群，在Modeltest軟件中基于分級似然比檢驗(Hierarchical likelihood ratio tests，hLRT)標準，篩選出Cytb基因片段最適核苷酸替代模型為HKY+G(G=0.2417)，使用PAUP軟件采用ML法構(gòu)建4種屬魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(圖3)。拓撲結(jié)果顯示，同種不同單倍型之間節(jié)點支持率均較高，種間聚類關(guān)系呈現(xiàn)為：少鱗和亞洲首先聚類、再與多鱗相聚，最后與斑聚類。從種間聚類關(guān)系也可以看出最先分化出的是少鱗和亞洲，其次是多鱗，斑是最晚分化出的魚類。參考Cytb基因每百萬年2%的核苷酸分歧速率[21]，計算得出斑與亞洲的分化時間約為1 400萬年前，而少鱗與多鱗的分化時間約為945萬年前。整體來看，4種屬魚類種間發(fā)生遺傳分化的時間均在中新世(Miocene)。

s代表堿基轉(zhuǎn)換，v代表堿基顛換。s meaned the transition; v meaned the transversion.圖2 線粒體DNA Cyt b基因堿基替代飽和度分析Fig.2 Saturation plot analysis for the substitutions of mtDNA Cyt b gene

圖3 基于ML法構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 ML phylogenetic tree based on haplotypes

3 討論

薛泰強等[13]基于Cytb基因片段計算得出4種科魚類(少鱗、多鱗、斑和銀S.bassensis)發(fā)生分化的時間在1 115～1 425萬年前，其中多鱗與少鱗、斑的分歧時間分別為1 140萬年和1 115萬年。本研究得出多鱗與少鱗的分化時間約945萬年、與斑發(fā)生分化時間約785萬年，二者存在不一致現(xiàn)象，這一方面可能與分析的同源基因序列片段長度不同有關(guān)，前者選擇了長度為402 bp的序列片段，本研究截取了變異位點分布相對均勻的372 bp序列片段；另一方面與本研究多鱗中可能混有其他種類的魚(Sihama02)有關(guān)，這也是導(dǎo)致種間分化時間與薛泰強等[13]的研究結(jié)果存在顯著差異的重要原因。為排除統(tǒng)計誤差和序列片段差異的影響，作者正在進一步結(jié)合其他分子標記技術(shù)和解剖學(xué)實驗以證明其可靠性。但總體來看，幾種魚遺傳分歧時間均發(fā)生在第三紀的中新世(Miocene)，該結(jié)果也印證了分布于印度洋-太平洋的科魚類在中新世演化發(fā)展成為本地種這一結(jié)論[28]。