半枝蓮中4種黃酮類化合物的含量測定*

SONG Haneun(宋漢恩)，任 燕

(濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 264003)

半枝蓮主要產于華東、華南、西南等地[1]，其全草入藥。半枝蓮具有多種功效，不僅可內用于治療多種炎癥，也可外用于跌打損傷[2]，但最為引人注目的是其抗癌功效[3-7]。半枝蓮化學成分多樣[8]，多名學者已經(jīng)證明半枝蓮中黃酮類物質為主要的藥效物質[9-10]。目前，半枝蓮中已檢測出幾十種黃酮類物質[4-5]。其中野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素和芹菜素是其主要的黃酮類成分，均具有一定的抗癌功效。因此，本試驗選用半枝蓮中野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素和芹菜素作為研究對象，建立一種同時測定半枝蓮中這四種化合物的高效液相色譜方法，該方法亦可用于不同產地半枝蓮中這四種黃酮類化合物的含量測定，用以判定藥材質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；TB-215D電子分析天平，丹佛儀器有限公司；EL204電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 試 藥

野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素、芹菜素，均購自青島捷世康生物科技有限公司。甲酸、甲醇、乙腈為色譜純，乙醇為分析純，純水。半枝蓮藥材來自四川、山東、江西、江蘇、湖南、湖北、河北、安徽、云南9個不同產區(qū)，由濱州醫(yī)學院藥學院生藥學教研室陳彩云鑒定為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don的干燥全草。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：A：甲醇；B：乙腈；C：0.1%甲酸水；梯度洗脫(見表1)；流速：1.0 mL/min，紫外檢測波長：335 nm，進樣量：10 μL，柱溫：30 ℃。

表1 梯度洗脫程序

2.2 標準品溶液

分別稱取野黃芩苷標準品、野黃芩素標準品、木樨草素標準品與芹菜素標準品適量，加甲醇制成濃度分別為1.02 mg/mL、0.221 mg/mL、0.205 mg/mL、0.200 mg/mL的標準品混合溶液。

2.3 供試品溶液

半枝蓮粉碎后，取藥材粉末約0.1 g，置于10 mL帶蓋EP管中，加50%乙醇水3 mL，充分浸泡后，100 kHz，60 ℃條件下超聲60 min(期間每隔5 min劇烈震搖一次，保證藥材提取充分)，然后靜置至室溫，離心后將上清液取出，進樣(10 μL)，進行分析。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別取“2.2”、“2.3”項下制備的對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按“2.1”的確定的色譜條件測定。結果供試品中四種黃酮類化合物得到了很好的分離，結果見圖1。

圖1 四種黃酮類化合物混合標準品(a)和半枝蓮樣品(b)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard for four flavonoids(a); scutellaria barbata(b)

2.5 方法學驗證

2.5.1 標準曲線與線性關系

將“2.2”配制好的各個濃度的4個化合物標準品的混合溶液，按“2.1”確定的色譜條件進行試驗，分別以四個化合物標準品的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標建立標準曲線，野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素、芹菜素分別在濃度范圍10.20～1020 μg/mL、2.21～221 μg/mL、2.05～205 μg/mL、2.00～200 μg/mL內線性關系良好，結果見表2。

表2 標準曲線方程

2.5.2 精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗

各取稱量半枝蓮的粗粉(0.1 g)，按照“2.3”的方法條件下用于精密度、穩(wěn)定性的考察。考察精密度試驗同一天連續(xù)進樣6次，考察穩(wěn)定性試驗分別于0 min、360 min、720 min、1080 min、1440 min、1800 min、2160 min各進樣一次，共進樣7次，由見表3可知，4個化合物的色譜峰的保留時間和峰面積的精密度、穩(wěn)定性RSD值均小于2.0%，表明該方法精密度、穩(wěn)定性良好。重復性試驗取同一稱量的半枝蓮粗粉(0.1 g)，稱取6份，按“2.3”方法制成供試品溶液，分別進樣一次。結果4個化合物的色譜峰的保留時間和峰面積的RSD值均小于3.0%，表明該方法重復性良好。結果見表3。

表3 供試品保留時間和峰面積的RSD值

2.5.3 加樣回收率

取少量江西半枝蓮粗粉6份，精密各稱取0.05 g，分別加野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素、與芹菜素適量，加50%乙醇3 mL，使上述4個標準品濃度分別為142.1 μg/mL、16.27 μg/mL、5.300 μg/mL、8.730 μg/mL。按“2.3”方法超聲提取，測定回收率，結果(見表4)測得回收率都在90.17%～107.4%范圍之內，回收率滿足樣品分析的要求。

表4 加樣回收率

2.6 九個不同產地半枝蓮中4種黃酮類化合物的含量測定

對九個不同產地半枝蓮進行含量測定，結果見表5。結果表明這四種黃酮類化合物在九種不同產地的半枝蓮中含量相差很大，其中以山東所產的半枝蓮中這四種黃酮類化合物的總量最高，且野黃芩苷在山東產半枝蓮中含量最高，野黃芩素在江蘇產半枝蓮中含量最高，木樨草素，芹菜素在湖南產半枝蓮中含量最高。

表5 九個不同產地半枝蓮中4種黃酮類化合物含量測定結果

3 結 論

3.1 提取溶劑醇水比的選擇

本試驗對半枝蓮粉末提取溶劑的醇水比進行了考察，分別以1:10、3:7、1:1、7:3、9:1五種溶劑醇水比進行考察，其中醇水比為1:1(50%醇水比)時，四種黃酮類化合物的色譜峰的峰面積最大，所以本試驗最終確定50%醇水比為最佳的提取溶劑醇水比。

3.2 物料比的選擇

本試驗對物料比分別為1:30、1:50兩種情況進行研究考察。其中物料比為1:30時，4種黃酮類化合物的色譜峰的峰面積最大，所以本試驗最終確定30倍用量的溶劑體積為最佳的提取溶劑用量。

3.3 流動相選擇

由于黃酮類物質的極性較大，且4種化合物結構相類似，因此采用梯度洗脫。其中甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)的梯度洗脫效果最好，且各成分的峰都能較好的分離，并有合適的保留時間，所以選擇甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)為最終流動相。

3.4 檢測波長的選擇

335 nm波長出現(xiàn)的色譜峰較多，并且大部分色譜峰吸收最強，因此確定335 nm波長作為檢測波長。