正丙醇對渾濁紅球菌PD630影響的代謝組學(xué)分析

楚美云 張林尚 婁文勇 宗敏華 唐語謙, 徐曉飛 楊繼國,

(1. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2. 華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東 東莞 523808)

渾濁紅球菌PD630擁有高脂質(zhì)產(chǎn)量[1-2]，適合于高細(xì)胞密度的方式來進行培養(yǎng)，并且可以代謝多種碳源[3-4]。該菌是用于工業(yè)生產(chǎn)微生物油脂極具潛力的菌株之一[5]，其基因組信息已被公布，遺傳改造體系也已建立。渾濁紅球菌PD630可以將醇類作為其碳源實現(xiàn)油脂的合成[6]，合成的油脂在醫(yī)療、保健領(lǐng)域以及生物能源領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用前景[7-8]。

一般而言，自然條件下油脂中偶數(shù)碳脂肪酸的含量比較高，奇數(shù)碳脂肪酸的含量低。而近些年的一些報道顯示奇數(shù)碳脂肪酸具有重要的功能特性。奇數(shù)碳脂肪酸可用作抗過敏、抗炎和抗真菌劑[9]。奇數(shù)碳脂肪酸在人體健康中也起著重要作用[10]。有文獻[11]報道正丙醇的添加對于提高渾濁紅球菌PD630中奇數(shù)碳脂肪酸的含量至關(guān)重要。然而，對于微生物而言，醇類可能會對其產(chǎn)生一定的毒害作用。比如對其細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生破壞作用，進而使得胞內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生外泄，原因是醇能改變細(xì)胞膜的流動性并破壞磷脂層[12]。此外，許多生理功能，包括營養(yǎng)物和離子的轉(zhuǎn)運以及細(xì)胞代謝都會受到醇的影響[13]。目前正丙醇對紅球菌PD630的毒害作用尚不清楚，紅球菌在正丙醇存在時的應(yīng)激機制尚不明確。

UPLC-Triple-TOF/MS非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析可以通過檢測微生物在經(jīng)受外部刺激前后，其體內(nèi)小分子代謝物的變化進而闡明微生物對外界刺激的應(yīng)激機制。紅球菌在正丙醇存在時的應(yīng)激機制還未見研究。試驗擬采用UPLC-Triple-TOF/MS對正丙醇存在條件下渾濁紅球菌PD630體內(nèi)的代謝物進行非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，并結(jié)合主成分分析(PCA)和正交最小偏二乘判別分析(OPLS-DA)對其進行多元統(tǒng)計分析、識別差異代謝物，分析短肽、磷脂和丙酰輔酶A(CoA)等代謝物的變化以探究渾濁紅球菌PD630對正丙醇的應(yīng)激機制；同時采用氣相色譜儀測定脂肪酸的變化，為后續(xù)的深入研究提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

渾濁紅球菌PD630(RhodococcusopacusPD630, DSMZ44193)：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。菌種保藏于體積濃度為25%的甘油溶液中，-80 ℃冰箱凍存。

1.2 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋：SQ510C型，廣州科朋科學(xué)儀器有限公司；

振蕩培養(yǎng)箱：ZQLY-180S型，上海知楚儀器有限公司；

醫(yī)用型潔凈工作臺：AIRTECH SW-CJ-2FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

氣相色譜儀：GC-2010PlusAF型，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；

超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時間質(zhì)譜儀：TripleTOF?6600型， 美國AB Sciex公司；

-80 ℃超低溫冰箱：DW-86L578J型，廣州科曉科學(xué)儀器有限公司。

1.3 主要培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基配方：牛肉膏粉3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，最終pH 7.4±0.2，250 mL三角瓶，裝液量為50 mL；

對照組發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖12 g/L，KH2PO41.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 9 g/L，尿素0.6 g/L，F(xiàn)eNaEDTA 5 mg/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2·2H2O 20 mg/L，MnCl2·4H2O 0.05 mg/L，CoCl2·6H2O 0.2 mg/L，H3BO30.3 mg/L，Na2MoO4·2H2O 2 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.1 mg/L，NiCl2·6H2O 0.02 mg/L，CuCl2·2H2O 0.01 mg/L[14-15]；

試驗組發(fā)酵培養(yǎng)基配方：在對照組發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加體積分?jǐn)?shù)1%正丙醇；

配置后裝入250 mL三角瓶，裝液量為100 mL。其中對照組和試驗組每組6個生物學(xué)重復(fù)。以上培養(yǎng)基均在121 ℃，20 min條件下滅菌，冷卻備用。

1.4 培養(yǎng)方法

(1) 種子培養(yǎng)：將菌種接入上述種子培養(yǎng)基，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h，即為種子液。

(2) 發(fā)酵培養(yǎng)：接種量1%，培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速分別為30 ℃、160 r/min。分別在48 h(對應(yīng)于指數(shù)期)和72 h(對應(yīng)于穩(wěn)定期)取樣，液氮淬滅，并置于-80 ℃冰箱備用。

1.5 GC測定脂肪酸

發(fā)酵培養(yǎng)84 h后，收集菌體、破壁提油。具體步驟：稱取1 g濕菌體置于10 mL提脂瓶中，加入4 mL 3 mol/L鹽酸、2 mL正己烷，振蕩30 s充分混勻；然后沸水浴煮5 min，邊煮邊振蕩；冷卻至室溫，離心(5 000×g，5 min)，收集正己烷層(上層)[16]。再對試樣進行甲酯化[17]，分析脂肪酸組成。色譜柱為HP-88(100 m×0.32 mm，0.22 μm)，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度270 ℃，汽化室溫度250 ℃，分流比20∶1，進樣體積2 μL，載氣N2。程序升溫設(shè)置：180 ℃保持5 min，以2 ℃/min 的速度提高到220 ℃，保持20 min[18]。以37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為標(biāo)準(zhǔn)進行定性分析，由相對質(zhì)量校正因子來修正的峰面積歸一化法進行計算脂肪酸的含量。

1.6 UPLC-MS分析

使用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Triple-TOF/MS)對樣品進行分析。色譜柱：Waters UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動相A為體積比1∶1乙腈—異丙醇溶液(含0.1%甲酸)，流動相B為水(含0.1%甲酸)。梯度洗脫，洗脫程序：0 min，5% A；3 min，20% A；9 min，95% A；13 min，95% A；14 min，5% A；16 min，5% A。柱溫40 ℃，進樣體積5 μL。質(zhì)譜條件：離子源溫度120 ℃；載氣流量900 L/h；電噴霧毛細(xì)管電壓1.0 kV；進樣電壓40 V；質(zhì)譜掃描范圍(m/z)50～1 000；分辨率30 000[11]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

將UPLC-Triple-TOF/MS獲得的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。然后將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入ropls軟件(Version1.6.2)中進行處理，并在Majorbio I-Sanger云平臺(https://www.i-sanger.com)對數(shù)據(jù)進行PCA以及OPLS-DA分析。同時在Majorbio I-Sanger云平臺(https://www.i-sanger.com)結(jié)合OPLS-DA模型的VIP值≥1和P值≤0.05確定樣品之間的顯著差異代謝物[19]。

原始數(shù)據(jù)用代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI 進行搜庫鑒定，將一級質(zhì)譜(MS)和二級質(zhì)譜(MS/MS)信息與代謝數(shù)據(jù)庫進行匹配。其中主要數(shù)據(jù)庫為https://metlin.scripps.edu/；http://www.hmdb.ca/等公共數(shù)據(jù)庫以及Majorbio I-Sanger云平臺(https://www.i-sanger.com)的自建數(shù)據(jù)庫。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，每組重復(fù)3次。P值<0.05時，認(rèn)為是具有顯著性差異。數(shù)據(jù)表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸組成

為了進一步印證正丙醇能夠提高渾濁紅球菌PD630所產(chǎn)油脂中奇數(shù)碳脂肪酸的百分含量，分析了體積分?jǐn)?shù)1%正丙醇添加量下菌油的脂肪酸組成，結(jié)果見表1。正丙醇的添加對油脂的脂肪酸含量影響較大。體積分?jǐn)?shù)1%正丙醇使奇數(shù)碳脂肪酸的含量從32.91%提高至79.66%，提升了46.75%。主要的奇數(shù)碳脂肪酸為C15:0(38.42%)、C17:0(17.56%)和C17:1(23.68%)。Zhang等[11]研究表明向培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)0.5%～1.5%正丙醇，奇數(shù)碳脂肪酸的含量提高了46.7%～55.1%，與試驗結(jié)果一致。

2.2 代謝組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

PCA分析結(jié)果(圖1)表明在48 h和72 h試驗組和對照組樣本在整體分布上有分離趨勢，但兩個主成分對X累積解釋率分別為0.650和0.608，表明PCA模型的穩(wěn)定性不夠高。主要原因是PCA是一種無監(jiān)督的模式，其分類判別能力還不夠強。

為了獲得更好的分離模型，采用OPLS-DA對數(shù)據(jù)進行進一步分析。結(jié)果表明，48 h時，模型對X矩陣?yán)鄯e解釋率為0.780，對Y矩陣的累積解釋率為0.991，模型預(yù)測能力良好(0.978)。72 h樣本，3個模型的參數(shù)分別為0.727，0.995，0.986，表明模型質(zhì)量較好，模型具有良好的可靠性和預(yù)測性。此外，由圖2可知，試驗組和對照組明顯分開，模型良好。

2.3 差異代謝物

由于OPLS-DA模型優(yōu)于PCA方法分析的結(jié)果，故使用OPLS-DA模型對差異代謝物進行分析，其熱圖見圖3。48 h的樣本中，試驗組與對照組的差異代謝物共有54種；72 h的樣本中，試驗組與對照組的差異代謝物有61種。在眾多的差異代謝物中，短肽和磷脂的變化最為突出。此外，丙酰CoA也發(fā)生了顯著變化。因此，重點分析這3類化合物。

表1 正丙醇對渾濁紅球菌PD630脂肪酸組成的影響Table 1 Effect of 1-propanol on the fatty acid profiles produced by Rhodococcus opacus PD630 %

圖1 試驗組和對照組各樣品在48 h和72 h的主成分分析(PCA)Figure 1 Principal component analysis (PCA) for the samples between test and control at 48 and 72 h

圖2 試驗組和對照組各樣品在48 h和72 h的正交最小偏二乘判別分析(OPLS-DA)Figure 2 Orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) for the samples between test and control at 48 and 72 h

在添加正丙醇后，菌體代謝物中短肽的豐度顯著下降，豐度下降的短肽主要有：Gamma-Glu-Leu、Glu-Val、Glu-Met、Glu-Tyr、Glu-Trp。這些短肽均含有谷氨酸殘基，谷氨酸殘基是重要的鮮味物質(zhì)。同時谷氨酸是已知的滲透保護劑，醇存在時，能夠起到保護作用[20-21]。

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實驗室培養(yǎng)渾濁紅球菌PD630時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的后期有風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，推測與這些短肽有關(guān)。這些短肽可能是紅球菌生長進入穩(wěn)定期后產(chǎn)生的信號分子。另外，短肽是氨基酸合成和分解的中間代謝產(chǎn)物，短肽的進一步降解生成氨基酸，進而進入氨基酸代謝途徑。而氨基酸代謝對于提高菌對醇的耐受性至關(guān)重要[22]。此外，短肽降解的增加在一定程度上防止了蛋白質(zhì)在溶劑激發(fā)下蛋白質(zhì)聚集或錯誤折疊[23-24]。試驗過程中發(fā)現(xiàn)添加丙醇時二肽的含量顯著下降，一方面可能是正丙醇抑制了某些酶，導(dǎo)致二肽信號分子的含量降低。另一方面，可能是菌啟動了自身的應(yīng)激機制，加速了蛋白質(zhì)的代謝，進而提高自身對正丙醇的耐受性。

菌體代謝物中磷脂分子的不飽和度增加顯著。由于磷脂是膜的主要結(jié)構(gòu)組分，對細(xì)胞的活力至關(guān)重要[25]，所以對磷脂的變化進行了研究。通過對磷脂上脂肪酸的不飽和度進行分析，圖4表明在正丙醇存在條件下磷脂分子的不飽和度增加，間接說明細(xì)胞膜的不飽和度增加。在長期暴露于醇中會改變膜中存在的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例，這種效應(yīng)主要取決于所用溶劑的碳鏈長度[26]。例如文獻[27]中報道，短鏈(C2～C4)烷醇存在時，菌會增加細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸濃度。然而，長鏈(C5～C9)烷醇會增加其飽和脂肪酸的含量[27]。菌是通過增加不飽和脂肪酸的濃度來保護膜功能，以最小化溶劑對雙層結(jié)構(gòu)的影響，或通過增加飽和脂肪酸以恢復(fù)膜中的順序[27-28]。由于有機溶劑會使得膜的流動性發(fā)生改變，并且引起磷脂雙層的穩(wěn)定性降低，因此細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)通過改變磷脂的生物合成速率和組成來補償這種情況。此外，不同的菌暴露在不同有機溶劑中所產(chǎn)生的應(yīng)激機制是不同的。Henderson等[25]通過脂質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)酵母通過改變脂質(zhì)組成來減輕乙醇的脅迫作用。而Nielsen等[29]發(fā)現(xiàn)溶血性葡萄球菌和芽孢桿菌ORAs2是通過增加膜流動性來適應(yīng)溶劑挑戰(zhàn)。

菌體代謝物中丙酰CoA的豐度上升顯著。丙酰CoA是產(chǎn)生奇數(shù)碳脂肪酸的關(guān)鍵中間體，因為合成奇數(shù)碳脂肪酸的主要起始底物是丙酰CoA。由圖5可知，正丙醇的加入使得丙酰CoA的豐度增加。以二碳單位的形式來對脂肪酸鏈進行延長是脂肪酸合成的方式。當(dāng)以丙酰CoA為起始底物每經(jīng)一個循環(huán)延伸兩個碳原子單元，所以最終生成的脂肪酸為奇數(shù)碳脂肪酸。例如在丙酰CoA的基礎(chǔ)上經(jīng)過6或7個循環(huán)時，最終分別產(chǎn)生C15:0和C17:0[30-31]。所以由丙酰CoA的豐度增加可以推斷奇數(shù)碳脂肪酸的合成將增加，與表1中脂肪酸的結(jié)果相吻合。表明正丙醇是通過影響丙酰CoA的豐度進而影響奇數(shù)碳脂肪酸的產(chǎn)生。

3 結(jié)論

采用UPLC-Triple-TOF/MS測定代謝物的變化，探究了紅球菌PD630在正丙醇存在時的應(yīng)激機制。并且運用氣相色譜對添加正丙醇的菌油的脂肪酸組成及含量進行了分析。結(jié)果表明：應(yīng)激機制主要表現(xiàn)在短肽減少、細(xì)胞膜磷脂的不飽和度增加且丙酰CoA出現(xiàn)顯著性的增加；奇數(shù)碳脂肪酸的含量從32.91%提高到79.66%。但試驗仍然還存在著一些問題有待解決，如在基因水平上解釋該應(yīng)激機制。

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