低濃度苯和甲醛經(jīng)呼吸道聯(lián)合染毒對(duì)小鼠雌性生殖毒性的影響

鄒麗君，高艷芳，賀印旎2，張娟，胡恭華

(1. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000；2. 邵陽學(xué)院生物遺傳教研室，湖南 邵陽 422000)

苯和甲醛作為常見的工業(yè)原料在各行各業(yè)中應(yīng)用廣泛，成為典型的職業(yè)環(huán)境污染物和室內(nèi)空氣污染物[1]，引發(fā)的健康問題也成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。苯和甲醛均是人類確認(rèn)的致癌物，兩種毒物共同暴露可導(dǎo)致造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多種健康損害[2-4]。其中雌性生殖功能損害涉及親子兩代、毒作用表現(xiàn)更復(fù)雜，尤其低濃度苯和甲醛于卵泡發(fā)育期的聯(lián)合暴露導(dǎo)致對(duì)雌性小鼠的生殖功能損害的研究較少。本文擬通過對(duì)卵泡發(fā)育期ICR小鼠進(jìn)行低濃度苯和甲醛的聯(lián)合暴露來探討苯和甲醛的雌性生殖毒性，為苯和甲醛的生殖毒性評(píng)價(jià)提供參考線索和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性ICR小鼠108只，平均體重26.56 g，SPF級(jí)雄性ICR小鼠27只，平均體重28.75 g[購自湖南斯克景達(dá)實(shí)驗(yàn)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002，使用許可證編號(hào)SYXK(贛)2018-0004)]。屏障環(huán)境飼養(yǎng)和染毒，溫度為18℃～24℃，濕度為40%～60%。

1.2儀器和試劑 55 L靜式染毒柜(實(shí)驗(yàn)室自制，塑料材質(zhì)、可密封、透明)，Sorvall ST 8R型高速冷凍式離心機(jī)(美國Thermo Fisher)，EON-EPOCH酶標(biāo)儀(美國Biotek)，ZXDP-R2800電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海智城)，玻璃勻漿器；苯(分析純，國藥集團(tuán))，37%甲醛水溶液(分析純，國藥集團(tuán))，0.01 M PBS緩存液，SOD和MDA試劑盒(南京建成)，F(xiàn)SH和LH酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢華美)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組和染毒 將108只SPF級(jí)雌性ICR小鼠采用兩個(gè)因素、三個(gè)劑量水平(32)的析因設(shè)計(jì)進(jìn)行隨機(jī)分組，苯和甲醛各三個(gè)劑量水平分別為：0 mg/m3、12 mg/m3、60 mg/m3和0 mg/m3、2 mg/m3、10 mg/m3，共有9個(gè)不同染毒組，每組12只。呼吸道靜式染毒，于雌鼠卵泡發(fā)育期連續(xù)染毒14 d，2 h/d(中間間隔1 h)。染毒期間禁食禁水，其余時(shí)間自由飲水?dāng)z食，每7 d測量一次體重。染毒第13 d、14 d清晨連續(xù)2 d采用普通光學(xué)顯微鏡觀察雌鼠陰道分泌物的方法判定雌鼠的動(dòng)情周期，篩選動(dòng)情期的雌鼠于染毒結(jié)束處死并采集生物標(biāo)本進(jìn)行指標(biāo)檢測，每組滿足6只，剩余雌鼠與雄鼠按2∶1的比例進(jìn)行持續(xù)3 d的合籠交配再分籠飼養(yǎng)至雌鼠產(chǎn)下仔鼠、喂養(yǎng)4 d后處理全部動(dòng)物。

1.3.2雌鼠體重的稱量 經(jīng)呼吸道14 d染毒期間每7 d測量一次體重，后續(xù)繼續(xù)交配并產(chǎn)仔的雌鼠每7 d測量一次體重。

1.3.3雌鼠動(dòng)情周期的判定 染毒第13 d、14 d清晨7：00對(duì)所有染毒雌鼠進(jìn)行陰道分泌物涂片檢查以判定動(dòng)情周期，第13 d篩選動(dòng)情前期動(dòng)物，篩選標(biāo)準(zhǔn)為鏡下有核上皮細(xì)胞占多、少量自細(xì)胞和角質(zhì)化上皮細(xì)胞，第14 d篩選動(dòng)情期動(dòng)物，篩選標(biāo)準(zhǔn)為鏡下大量角質(zhì)化上皮細(xì)胞、典型樣本呈落葉狀。通過連續(xù)2 d對(duì)雌鼠動(dòng)情周期的判定以保證染毒結(jié)束時(shí)處死的雌鼠均同步在動(dòng)情期，雌鼠性激素水平具有可比性，每組滿足6只。

1.3.4雌鼠臟器系數(shù)的計(jì)算 染毒結(jié)束時(shí)篩選動(dòng)情期的雌鼠采血后處死并解剖分離心、肝、脾、腎、子宮、卵巢，小心剪除結(jié)締組織后于PBS緩沖液沖洗血污，濾紙吸干后快速在電子天平上稱量并記錄。

1.3.5雌鼠子宮組織超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量測定 染毒結(jié)束時(shí)將篩選動(dòng)情期的雌鼠處死，解剖分離子宮，稱量約0.1 g子宮組織與PBS緩沖液按1∶9用玻璃勻漿器制備10%子宮勻漿，10 min 3000 r/min離心，取上清液按照南京建成試劑盒的說明書測定和計(jì)算子宮組織SOD活力和MDA含量。

1.3.6雌鼠血清卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)含量測定 染毒結(jié)束時(shí)篩選動(dòng)情期雌鼠進(jìn)行10%水合氯醛麻醉后摘眼球取血，5 min 2000 r/min離心分離血清，按照武漢華美酶聯(lián)免疫試劑盒的說明書測定和計(jì)算FSH和LH含量。

1.3.7母鼠生育力及胎仔發(fā)育毒性判定 觀察交配行為及妊娠結(jié)局(產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)，每窩平均體重)，計(jì)算生育指數(shù)、妊娠指數(shù)、活產(chǎn)指數(shù)和4 d存活指數(shù)。生育指數(shù)=(與雄鼠交配受孕的雌鼠數(shù)/與雄鼠同籠的雌鼠數(shù))×100%，妊娠指數(shù)=(正常分娩雌鼠數(shù)/妊娠的雌鼠數(shù))×100%，活產(chǎn)指數(shù)=(活產(chǎn)胎仔數(shù)/胎仔總數(shù))×100%，4 d存活指數(shù)=(哺乳4 d存活仔鼠數(shù)/活產(chǎn)胎仔總數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d雌鼠體重變化情況 苯不同劑量組雌鼠體重增長不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，甲醛不同劑量組的體重增長呈現(xiàn)劑量越高增長越緩慢趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，苯和甲醛聯(lián)合染毒對(duì)雌鼠的體重增長有交互作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合組體重增長較少(G6組平均體重增長為1.68 g)，高劑量聯(lián)合組體重增長較多(G9組平均體重增長為2.95 g)。合籠交配產(chǎn)仔的孕鼠因受孕時(shí)間有先后，受孕后的體重變化無法同步，組間和組內(nèi)的體重變化雖有記錄但缺乏可比性。見表1、表2。

表1 苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d雌鼠體重變化情況

表2 各組雌鼠體重變化方差分析結(jié)果

2.2苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d對(duì)雌鼠臟器系數(shù)的影響 各處理組的心臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、子宮系數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無主效應(yīng)及交互作用；苯不同劑量組和甲醛不同劑量組的脾臟系數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，無交互作用；苯不同劑量組的腎臟系數(shù)、卵巢系數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甲醛不同劑量組的腎臟系數(shù)、卵巢系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，無交互作用。見表3、表4

表3 苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d對(duì)雌鼠臟器系數(shù)的影響

表4 各組雌鼠臟器系數(shù)方差分析結(jié)果

2.3苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d對(duì)雌鼠子宮組織SOD活力和MDA含量的影響 苯不同劑量組和甲醛不同劑量組的子宮組織SOD活力的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，無交互作用；甲醛不同劑量組的子宮組織MDA含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，苯和甲醛聯(lián)合染毒對(duì)雌鼠子宮組織MDA含量有交互作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合組升高較少(G6組平均MDA含量為6.50 nmol/mg prot)，高劑量聯(lián)合組升高較多(G9組平均MDA含量為7.79 nmol/mg prot)，但均低于高劑量甲醛組(G5組平均MDA含量為9.04 nmol/mg prot)。見表5、表6。

表5 苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d對(duì)雌鼠子宮組織SOD活力和MDA含量的影響

2.4苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d對(duì)雌鼠血清FSH和LH的影響 苯和甲醛單獨(dú)染毒對(duì)雌鼠血清FSH無主效應(yīng)，苯和甲醛聯(lián)合染毒對(duì)雌鼠血清FSH有交互作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合組升高較多(G6組平均FSH為64.52 mIU/ml)，高劑量聯(lián)合組升高較少(G9組平均FSH為54.85 mIU/ml)。各處理組的LH差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無主效應(yīng)及交互作用。見表7、表8。

表6 各組雌鼠子宮組織SOD活力和MDA含量方差分析結(jié)果

表7 苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d對(duì)雌鼠血清FSH和LH的影響

表8 各組雌鼠血清FSH和LH方差分析結(jié)果

2.6苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d對(duì)雌鼠生育力和胎仔發(fā)育的影響 苯和甲醛單獨(dú)染毒時(shí)低劑量組的生育指數(shù)均低于高劑量組，而低劑量組的妊娠指數(shù)均高于高劑量組，苯和甲醛低劑量聯(lián)合組的生育指數(shù)高、妊娠指數(shù)低，高劑量聯(lián)合組的生育指數(shù)低、妊娠指數(shù)高；苯不同劑量組的產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、活仔重、4 d存活指數(shù)及4 d活仔重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甲醛不同劑量組的產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、活仔重、4 d存活指數(shù)及4 d活仔重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，苯和甲醛聯(lián)合染毒的14 d存活指數(shù)、4 d活仔重有交互作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合組降低(G6組平均4 d存活指數(shù)為93.60%及4 d活仔平均重為2.33 g)，高劑量聯(lián)合組升高(G9組平均4 d存活指數(shù)為100.00%及4 d活仔平均重為2.61 g)。見表9、表10、表11。

表9 苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d對(duì)雌鼠生育力的影響

表10 苯和甲醛聯(lián)合染毒14 d對(duì)胎仔發(fā)育的影響

表11 各組胎仔發(fā)育方差分析結(jié)果

3 討論

苯和甲醛作為人類確認(rèn)的致癌物和致突變物，經(jīng)常聯(lián)合暴露于職業(yè)環(huán)境和室內(nèi)環(huán)境，如化工行業(yè)中用于原料生產(chǎn)各類化工產(chǎn)品、作為溶劑和助劑用于噴漆印刷行業(yè)和家居裝修材料等。職業(yè)流行病學(xué)調(diào)查顯示職業(yè)環(huán)境苯暴露可導(dǎo)致女工月經(jīng)紊亂，增加自然流產(chǎn)率，降低女性生育能力[5-6]，對(duì)新裝修居室的人群進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)女性生殖功能損害與居室環(huán)境的苯和甲醛暴露相關(guān)[7]。隨著國家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的推廣實(shí)施，職業(yè)環(huán)境和室內(nèi)環(huán)境中苯和甲醛的暴露通常在較低的水平，在這種情況下，兩者是否存在聯(lián)合作用、其生殖損害呈現(xiàn)何種特征是一個(gè)新的命題。

本次研究采用兩個(gè)因素、三個(gè)劑量水平(32)的析因設(shè)計(jì)對(duì)卵泡發(fā)育期的ICR雌鼠進(jìn)行單獨(dú)染毒和聯(lián)合染毒，苯和甲醛各三個(gè)劑量水平分別為：0 mg/m3、12 mg/m3、60 mg/m3和0 mg/m3、2 mg/m3、10 mg/m3，連續(xù)染毒14 d，基本覆蓋雌鼠3個(gè)動(dòng)情周期，以確保交配時(shí)排出的卵子都存在毒物暴露，染毒結(jié)束后每組篩選6只動(dòng)情期的動(dòng)物檢測性激素等指標(biāo)，每組其他雌鼠繼續(xù)觀察交配分娩產(chǎn)仔等生殖毒性終點(diǎn)。本研究的設(shè)計(jì)特點(diǎn)有：①依據(jù)職業(yè)環(huán)境和室內(nèi)環(huán)境低濃度、聯(lián)合暴露的情況，采用低濃度苯(12 mg/m3、60 mg/m3)和甲醛(2 mg/m3、10 mg/m3)聯(lián)合暴露，分析兩種毒物單獨(dú)染毒的毒效應(yīng)及聯(lián)合染毒的毒效應(yīng)，為職業(yè)和環(huán)境衛(wèi)生評(píng)價(jià)提供參考；②與傳統(tǒng)胚胎植入期、器官形成期染毒不同，本次研究選擇卵泡發(fā)育期進(jìn)行雌性動(dòng)物染毒，染毒后即雌雄交配，毒物作用于卵細(xì)胞的發(fā)育過程，為育齡期女性生殖功能損害提供參考；③實(shí)驗(yàn)觀察的終點(diǎn)涉及親子兩代，既有母鼠的系統(tǒng)毒性、生育力，又有胎仔的發(fā)育毒性，從親子兩代闡述毒物的生殖損害，為苯和甲醛的生殖毒性評(píng)價(jià)提供參考。

體重是反映機(jī)體系統(tǒng)毒性的重要指標(biāo)，從染毒期間雌鼠體重變化的析因分析結(jié)果來看，苯不同劑量組雌鼠體重增長不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甲醛不同劑量組的體重增長無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，苯和甲醛聯(lián)合染毒對(duì)雌鼠的體重增長有交互作用，表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合組體重增長較少，高劑量聯(lián)合組體重增長較多，說明該劑量下的苯對(duì)小鼠體重的影響要高于甲醛，聯(lián)合染毒時(shí)甲醛的暴露抵消了苯對(duì)體重的影響。動(dòng)物臟器系數(shù)的改變?yōu)榇_定毒作用的靶器官提供線索。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，14 d短時(shí)間、低濃度的苯暴露對(duì)脾臟系數(shù)有一定影響，提示該劑量下的苯對(duì)造血系統(tǒng)有損害，而甲醛不同劑量組的脾臟、腎臟、卵巢系數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示卵巢可能是甲醛導(dǎo)致生殖損害的靶器官，結(jié)合中醫(yī)方面的補(bǔ)腎養(yǎng)血方治療卵巢儲(chǔ)備功能下降的臨床實(shí)踐[8]及建立早發(fā)性卵巢功能不全腎虛血瘀證的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[9]等相關(guān)文獻(xiàn)，提示甲醛對(duì)小鼠生殖損害的作用機(jī)制可能涉及因腎臟、脾臟功能不全導(dǎo)致的卵巢儲(chǔ)備功能下降，進(jìn)而影響母鼠的生育力和胎仔的發(fā)育。

FSH和LH是反映卵巢儲(chǔ)備的重要指標(biāo)，若卵巢儲(chǔ)備功能降低，F(xiàn)SH和FSH/LH比值會(huì)升高[10]，廣西壯族絕經(jīng)婦女雌激素受體-β基因多態(tài)性與促卵泡刺激素、黃體生成素和雌孕激素的研究也證實(shí)α基因組的促卵泡刺激素、黃體生成素明顯下調(diào)，其臨床預(yù)后較好[11]，提示促卵泡刺激素與雌性生殖功能負(fù)相關(guān)。從FSH的變化可以看出，苯和甲醛單獨(dú)染毒對(duì)雌鼠血清FSH無主效應(yīng)，苯和甲醛聯(lián)合染毒對(duì)雌鼠血清FSH有交互作用，表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合組升高，高劑量聯(lián)合組降低，說明聯(lián)合染毒導(dǎo)致的毒效應(yīng)不同與各毒物單獨(dú)染毒，低劑量組毒效應(yīng)高于高劑量組。結(jié)合胎仔的胚胎毒性來看，甲醛不同劑量組的產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、活仔重、4 d存活指數(shù)及4 d活仔重不同，低劑量甲醛組低于高劑量甲醛組，苯和甲醛聯(lián)合染毒時(shí)低劑量聯(lián)合組的4 d存活指數(shù)及4 d活仔重也低于高劑量聯(lián)合組。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李輝等[12]的研究類似，與高劑量甲醛組相比，低劑量甲醛組的胚胎毒性更明顯；低劑量聯(lián)合時(shí)毒效應(yīng)增大，高劑量聯(lián)合時(shí)毒效應(yīng)相互抵消，4 d存活指數(shù)和4 d活仔重都有回升。

綜上，低濃度苯(12 mg/m3、60 mg/m3)和甲醛(2 mg/m3、10 mg/m3)聯(lián)合暴露對(duì)ICR小鼠的體重增長有影響，存在系統(tǒng)毒性，結(jié)合臟器系數(shù)的變化來看，可以推測該劑量下的暴露可導(dǎo)致卵巢等多種臟器的損傷。以往苯和甲醛生殖毒性研究多以雄性動(dòng)物染毒或孕鼠胚胎植入期、器官形成期染毒，此次我們選擇卵泡發(fā)育期的ICR雌鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行呼吸道染毒，外推到人類即為育齡期的職業(yè)女工，多以呼吸道接觸毒物，又不能享受孕期和哺乳期女工的勞動(dòng)待遇，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示苯和甲醛低濃度、短時(shí)間的聯(lián)合暴露導(dǎo)致的雌性生殖損害既有主效應(yīng)又有交互作用，提示目前苯與甲醛的職業(yè)接觸限值對(duì)職業(yè)女工的生殖健康存在一定風(fēng)險(xiǎn)。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，甲醛的生殖損害更明顯，多個(gè)指標(biāo)在甲醛不同劑量組有差異，苯和甲醛聯(lián)合染毒有交互作用，表現(xiàn)為低劑量聯(lián)合組的毒效應(yīng)要高于高劑量聯(lián)合組，可能聯(lián)合染毒時(shí)苯的暴露對(duì)甲醛的毒效應(yīng)存在抵消，但考慮到樣本量和實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，其交互作用具體為拮抗還是協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究。