Pyk2促進(jìn)血管緊張素II誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大

鄢 雯，劉立新，孔祥照，駱雨辰，李中秋，李 囡

(首都醫(yī)科大學(xué) 燕京醫(yī)學(xué)院， 北京 101300)

心肌肥大(cardiac hypertrophy)是心臟適應(yīng)血流動(dòng)力超負(fù)荷的一種代償反應(yīng)。病理性心肌肥大是引起心血管疾病發(fā)生的一種重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，持續(xù)性的心肌肥大失代償后將導(dǎo)致心肌收縮力減退和心力衰竭[1-2]，嚴(yán)重危害人體健康，探討其發(fā)生機(jī)制具有重要意義。Pyk2(proline-rich tyrosine kinase-2)，即黏著斑激酶家族新成員，是一種富含脯氨酸的酪氨酸激酶，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中占有重要地位，活化的Pyk2能參與ROS產(chǎn)生、凋亡信號(hào)傳導(dǎo)和心肌細(xì)胞死亡等過程[3]。有報(bào)道Pyk2在神經(jīng)細(xì)胞缺血損傷和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮重要作用[4-5]。本研究主要探討Pyk2對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：出生3 d內(nèi)的SPF級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠乳鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]。

1.1.2 試劑：血管緊張素II(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ), anti-PYK2(phospho Y402)antibody和anti-PYK2 antibody(Abcam公司)；PF-431396(Pyk2抑制劑)(Selleck公司)；p53 antibody和GAPDH antibody(南京恩晶生物科技有限公司)；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；Trizol總RNA抽提試劑(Sigma-Aldrich公司)；SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司)；GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Thermo Fisher公司)；免疫化學(xué)發(fā)光HRP底物(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)的分組及處理：常規(guī)提取大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、Ang Ⅱ誘導(dǎo)組、PF-431396組及PF-431396干預(yù)Ang Ⅱ誘導(dǎo)組。其中對(duì)照組的心肌細(xì)胞給予DMEM培養(yǎng)；Ang Ⅱ誘導(dǎo)組的心肌細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)條件下，給予終濃度為100 nmol/L的Ang Ⅱ刺激24 h；PF-431396組的心肌細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)條件下，給予終濃度為10 μmol/L的PF-431396，在Ang Ⅱ刺激前30 min加入；PF-431396干預(yù)Ang Ⅱ誘導(dǎo)組的心肌細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)條件下，給予終濃度為100 nmol/L的Ang Ⅱ刺激24 h，在Ang Ⅱ刺激前30 min，加入終濃度為10 μmol/L的PF-431396。

1.2.2 細(xì)胞骨架蛋白(α-actinnin)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大：4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片，室溫30 min，1×PBS沖洗，5 min/3次；封閉通透室溫30 min，1×PBS沖洗，5 min/3次；滴加α-actinnin一抗(10～20 μg/mL)，4 ℃搖床過夜；隔天從4 ℃取出復(fù)溫20 min，1×PBS沖洗，5 min/3次；加二抗室溫孵育1 h，1×PBS沖洗，5 min/3次；滴加DAPI染核5 min，1×PBS沖洗，5 min/3次；蒸餾水、75%、95%、和100%乙醇各10 s；碘化鈉甘油封片。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)肥大指標(biāo)的mRNA：mRNA提取、定量和反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)方法見文獻(xiàn)[10]。引物的設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成(表1)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞中p-Pyk2、Pyk2及p53蛋白表達(dá)：提取心肌細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品變性上樣，進(jìn)行電泳和電轉(zhuǎn)。封閉液室溫封閉30 min，稀釋一抗， 4 ℃搖床孵育過夜，稀釋二抗，室溫?fù)u床緩慢孵育1 h，利用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行蛋白條帶檢測(cè)。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ang Ⅱ上調(diào)心肌細(xì)胞p-Pyk2表達(dá)

Ang Ⅱ組心肌細(xì)胞中p-Pyk2蛋白水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)(圖1)。

2.2 PF-431396抑制心肌肥大

與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組的心肌細(xì)胞表面積明顯增大(P<0.05)，PF-431396干預(yù)組表面積明顯減小(P<0.05)(圖2A)。

Ang Ⅱ組的肥大指標(biāo)的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，PF-431396明顯降低肥大指標(biāo)的mRNA水平(P<0.05)(圖2B)。

2.3 PF-431396降低p-Pyk2和p53的蛋白水平

心肌細(xì)胞經(jīng)Ang Ⅱ刺激后，p-Pyk2和p53蛋白水平較對(duì)照組升高(P<0.05)，PF-431396明顯降低其表達(dá)(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group圖1 Ang Ⅱ刺激下p-Pyk2的蛋白表達(dá)增加Fig 1 Ang Ⅱ increased the protein expression of p-Pyk2 compared with

A.size of cardiomyocytes was detected by α-actinin fluorescence staining; B.mRNA level of hypertrophic markers (ANP and β-MHC) was detected by RT-qPCR; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Ang Ⅱ group圖2 Pyk2抑制劑PF-431396對(duì)心肌肥大指標(biāo)的影響Fig 2 Effect of Pyk2 inhibitor PF-431396 on the level of cardiac

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Ang Ⅱ group圖3 加入PF-431396后 p-Pyk2和p53蛋白表達(dá)水平Fig 3 Protein levels of p-Pyk2 and p53 after adding

3 討論

Pyk2作為一種酪氨酸蛋白激酶，是黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)家族的新成員，在許多細(xì)胞中都可表達(dá)[6]，并參與細(xì)胞增殖、分化以及某些疾病的發(fā)生發(fā)展。Pyk2可被一系列因子激活，如生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein coupled receptor，GPCR)、Ang Ⅱ以及緩激肽等。體外培養(yǎng)幼年及成年鼠心肌細(xì)胞中，Pyk2可被ET-1迅速激活[7]。在壓力負(fù)荷導(dǎo)致的左室肥厚模型中，Pyk2被激活并發(fā)揮重要作用；在心臟移植手術(shù)失敗的心臟中，Pyk2的表達(dá)和活性也顯著增加[8]。

Ang Ⅱ通過與血管緊張素Ⅱ 1型受體 (angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R) 結(jié)合調(diào)節(jié)心肌的正性變力、變時(shí)作用及心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，參與調(diào)控心血管系統(tǒng)的功能和疾病的發(fā)生[9-10]。本結(jié)果顯示，Ang Ⅱ可明顯上調(diào)肥大心肌細(xì)胞中p-Pyk2的蛋白水平，提示Ang Ⅱ激活Pyk2。PF-431396作為Pyk2的一種有效抑制劑參與疾病的發(fā)展。PF-431396通過抑制Pyk2/MCU通路阻止Ca2+超載、線粒體損傷及細(xì)胞死亡[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PF-431396可使p-Pyk2的蛋白水平明顯降低，心肌肥大指標(biāo)也明顯改善，包括心肌細(xì)胞表面積減小，肥大指標(biāo)的mRNA水平也明顯降低，提示Pyk2的激活參與Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生。

Pyk2在腎臟組織中能被Ang Ⅱ激活，并通過介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮一定作用[11]。腫瘤抑制基因p53，通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡，達(dá)到抑制細(xì)胞增值的作用，在心肌肥大中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Ang Ⅱ可通過抑癌基因p53，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大過程[12-13]。p53與Pyk2存在一定聯(lián)系，在許多疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[14]。為了明確Pyk2在Ang Ⅱ誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，本研究檢測(cè)了Ang Ⅱ誘導(dǎo)下腫瘤抑制基因p53的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p53的蛋白水平明顯升高，而加入PF-431396后，表達(dá)明顯降低。

綜上所述，富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2)可通過調(diào)控腫瘤抑制基因p53的表達(dá)，促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，這將為臨床心肌肥大的治療提供一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。