萆苓方對(duì)糖尿病痛風(fēng)模型大鼠PGE2、COX-2 水平的影響*

★ 周媛媛 李中南

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 合肥 230031）

隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)糖尿病和痛風(fēng)的患病率逐年上升，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。兩病的發(fā)生與高血脂、高血壓、肥胖、遺傳等息息相關(guān)，且兩病之間可互相影響，互為危險(xiǎn)因素［1］。前列腺素（prosta-glandins，pGs）是花生四烯酸（rachidonicacid）的代謝產(chǎn)物,它是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，可誘發(fā)人和動(dòng)物的急性炎癥反應(yīng),其中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）起著重要的作用。環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGE2 的關(guān)鍵酶，COX-2 作為其中一個(gè)亞型，在受到刺激時(shí)表達(dá)迅速上調(diào)，參與多種病理生理過(guò)程。本文旨在觀察中藥萆苓方對(duì)糖尿病痛風(fēng)模型大鼠血清中PGE2、COX-2 表達(dá)水平的影響，探討萆苓方治療糖尿病合并痛風(fēng)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取清潔級(jí)健康SD 雄性大鼠50 只，體重（180±20）g，購(gòu)自于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)scxk（皖）2017001。大鼠飲食、活動(dòng)正常，皮毛光澤，反應(yīng)靈敏。飼養(yǎng)房室內(nèi)溫度25℃～30℃，相對(duì)濕度40%～70%，空氣流通。

1.2 試藥 萆苓方（由萆薢、土茯苓、澤瀉、黃柏、蒼術(shù)、懷牛膝、威靈仙、虎杖、薏苡仁、當(dāng)歸、土鱉蟲等藥物組成，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥物制劑中心提供）；吲哚美辛片（上海新黃河制藥有限公司，藥準(zhǔn)字號(hào)：H31020148，產(chǎn)品批號(hào)：01717004）；吡格列酮（江蘇德源藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào):H20110048）；尿酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S16N8I46625）；吐溫80（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：M19A6K2526）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：20160805426）；PGE2 試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號(hào)：20180412）；COX-2 試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號(hào)：20180412）。

1.3 主要儀器 血糖監(jiān)測(cè)儀（美國(guó)強(qiáng)生公司，型號(hào)：穩(wěn)豪型）；酶標(biāo)儀（雷杜公司，型號(hào)：RT-6000）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司，型號(hào)：JW3021HR）；漩渦混合器（其林貝爾儀器制造公司，型號(hào)：GL-88B），移液器（Eppendorf公司，型號(hào)：0.5～1000μL），排槍（Eppendorf 公司，型號(hào)：50～300μL），電熱恒溫箱（上海三發(fā)公司 型號(hào)：DNP-9052BS-Ⅲ）。

1.4 糖尿病模型制作 選取健康雄性SD 大鼠45只，體重（180±20）g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按數(shù)字表法隨機(jī)選出9 只作為正常組，予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余作為實(shí)驗(yàn)組，給予高脂飼料（蛋白質(zhì)15%、脂肪20%、碳水化合物50%、膽固醇5%、豬油10%）喂養(yǎng)。4 周后造模，造模前禁食不禁水12h，臨用前將pH4.5 的檸檬酸緩沖液與STZ 配制成1%濃度的STZ 溶液，模型組及各藥物組按35mg/kg 單次腹腔注射STZ 溶液，正常組按此用量折算出相當(dāng)量的生理鹽水注射一次。72h 后尾靜脈取血測(cè)血糖，以血糖≥16.7mmol/L 作為糖尿病成模的標(biāo)準(zhǔn)［2-3］。

1.5 痛風(fēng)關(guān)節(jié)模型制作 糖尿病模型成功后，大鼠給藥4 天，第四天除正常組外，每只實(shí)驗(yàn)鼠均選右側(cè)踝關(guān)節(jié)外后方為穿刺點(diǎn)，針口斜面朝前上方與脛骨成45 度夾角穿入踝關(guān)節(jié)腔，以4 號(hào)針頭向關(guān)節(jié)腔注入0.2mL 尿酸鈉溶液（取250mg 尿酸鈉結(jié)晶，加入45mL 0.9%氯化鈉注射液，再加5mL 吐溫80，加熱攪拌，配成5g/L 的尿酸鈉溶液）一次，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)，誘導(dǎo)痛風(fēng)模型［4］。正常組注射等量生理鹽水。

1.6 分組及給藥 將成模的實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為模型組、萆苓方組、吲哚美辛組、吡格列酮組，萆苓方組按10g/kg、吲哚美辛組按5mg/kg、吡格列酮組按15mg/kg 給藥，正常組、模型組予等量生理鹽水，每日灌胃1 次，連續(xù)3 周。期間剔除未成模大鼠2 只，因感染死亡大鼠3 只。

1.7 觀察指標(biāo) 大鼠連續(xù)給藥3 周，并監(jiān)測(cè)動(dòng)物體重變化。末次給藥后禁食12h，處死前稱體重，以10%水合氯醛按3.5mL/kg 腹腔注射麻醉，立即取腹主動(dòng)脈血，送至安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院生化室測(cè)定血糖、血尿酸、PGE2、COX-2。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料的數(shù)據(jù)用 表示，兩組比較采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行處理，組間比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并做相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠體重的影響 見(jiàn)表1。結(jié)果提示：大鼠造模后，模型組、吡格組、萆苓組、吲哚組大鼠體重均低于正常組（P＜0.05 或P＜0.01），治療后3 周后，吡格組、萆苓組大鼠體重明顯高于模型組（P＜0.05），組間比較，萆苓組與吡格組療效相近（P＞0.05），吡格組療效明顯優(yōu)于吲哚組（P＜0.05）。

表1 對(duì)大鼠體重的影響（，n=9） g

表1 對(duì)大鼠體重的影響（，n=9） g

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；與吲哚組比較，△P＜0.05。

組別 造模前 治療1 周后 治療2 周后 治療3 周后正常組 199.78±14.76 209.89±13.36 220.44±11.59 229.56±10.89模型組 200.44±10.79 190.33±12.43## 178.11±11.33 170.56±9.68吡格組 199.67±12.35 196.33±12.29# 192.56±13.86 189.00±17.21*△萆苓組 200.67±12.47 195.44±13.76# 190.00±13.97 184.44±15.13*吲哚組 201.11±12.34 194.44±12.15# 185.78±12.29 174.22±11.29

2.2 對(duì)大鼠血糖、血尿酸的影響 見(jiàn)表2。結(jié)果提示：與正常組相比，模型組、各藥物組大鼠血糖明顯升高（P＜0.01），與模型組相比，治療后萆苓組、吡格組大鼠血糖明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），組間比較，萆苓組、吡格組療效優(yōu)于吲哚組（P＜0.05）；與正常組相比，模型組血尿酸明顯升高（P＜0.01），與模型組比較，萆苓組、吲哚組大鼠血尿酸明顯降低（P＜0.01），組間比較，萆苓組、吲哚組療效相近（P＞0.05），且明顯優(yōu)于吡格組（P＜0.01）。

表2 對(duì)大鼠血糖、血尿酸的影響（，n=9）

表2 對(duì)大鼠血糖、血尿酸的影響（，n=9）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；組間比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別療前血糖/mmol·L-1療后血糖/mmol·L-1血尿酸/μmol·L-1正常組 5.72±0.97 5.76±0.80 73.00±7.31模型組 18.13±2.27## 17.55±3.14 144.25±25.35##吡格組 16.45±3.72## 12.71±2.18**△ 138.25±15.82萆苓組 16.06±2.19## 14.00±2.32*△ 92.86±17.25**△△吲哚組 17.46±2.06## 15.19±1.28 90.88±22.04**△△

2.3 對(duì)大鼠PGE2、COX-2 的影響 見(jiàn)表3。結(jié)果提示：與正常組相比,模型組COX-2、PGE2 的含量明顯升高（P＜0.01），與模型組相比，各藥物組COX-2、PGE2 的含量明顯降低（P＜0.01），組間比較，吲哚組與萆苓組COX-2、PGE2 療效相近（P＞0.05），優(yōu)于吡格組（P＜0.01）。

表3 對(duì)大鼠PGE2、COX-2的影響（，n=9）ng/L

表3 對(duì)大鼠PGE2、COX-2的影響（，n=9）ng/L

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與吡格組比較，△P＜0.05

組別 COX-2 PGE2 正常組 59.86±4.62 81.34±2.48模型組 145.72±12.35## 324.16±20.10##萆苓組 86.82±3.55**△ 145.69±10.33**△吡格組 107.18±10.93** 199.86±16.12**吲哚組 82.86±3.39**△ 142.09±14.69**△

2.4 相關(guān)分析 經(jīng)分析顯示，高血糖與高血尿酸具有相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.346（P＜0.05）；高血糖與COX-2 有顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.634（P＜0.01）；高血糖與PGE2 有顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.652（P＜0.01）；高尿酸與COX-2 的具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.732（P＜0.01）；高尿酸與PGE2 相關(guān)性，r=0.750（P＜0.01）；COX-2 與PGE2具有顯著相關(guān)性，r=0.945（P＜0.01）。

3 討論

有研究表明，糖尿病和痛風(fēng)有共同的發(fā)病基礎(chǔ)，血尿酸增高可加重糖尿病患者的代謝紊亂［5］，痛風(fēng)合并糖尿病患者的血尿酸水平也比單純痛風(fēng)患者更高［6］。因此，能夠同時(shí)改善高血糖與高血尿酸水平的藥物，對(duì)于提高療效，改善患者依從性，具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)正是探討了中藥萆苓方對(duì)于血糖、血尿酸及PGE2、COX-2 的影響。

前列腺素作為是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物,能保護(hù)胃和十二指腸粘膜,維護(hù)腎及血小板功能,但也可誘發(fā)人和動(dòng)物的急性炎癥反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞膜上磷脂酶A2 （phoshPolipaseA2）受到致炎因子等某種因素的刺激時(shí),釋放花生四烯酸，在環(huán)氧化酶的作用下，產(chǎn)生大量PGE2，引起并加重一系列炎癥反應(yīng)，促使局部毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管通透性增加，組織充血水腫，加重疼痛［7-11］，還可導(dǎo)致胰島 β 細(xì)胞的功能障礙［12］，影響胰島素的分泌。本次實(shí)驗(yàn)顯示，模型組PGE2 的含量明顯升高（P＜0.01），藥物治療后，萆苓組PGE2 的含量明顯降低（P＜0.01）。表明萆苓方可通過(guò)降低PGE2 的水平，減輕炎癥反應(yīng)，緩解糖尿病痛風(fēng)的臨床癥狀，降低血糖、血尿酸水平。

環(huán)氧化酶-2 是環(huán)氧化酶的一個(gè)亞型，研究表明［13］，其在正常狀態(tài)下幾乎不表達(dá)，一旦受到刺激如外傷、炎癥后迅速合成，增加血管通透性，產(chǎn)生炎性因子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化，激活基質(zhì)金屬蛋白酶，活化白細(xì)胞和血小板，且能降低人體對(duì)胰島素的敏感性。另一方面，COX-2 作為PGE2 的限速酶，與PGE2 有交互作用，它催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGE2，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，抑制胰島β 細(xì)胞的功能。本次實(shí)驗(yàn)表明，模型組COX-2 的表達(dá)明顯升高（P＜0.01），給藥后，萆苓組COX-2 的含量明顯降低（P＜0.01）。說(shuō)明萆苓方可通過(guò)抑制COX-2的高表達(dá)，緩解炎癥反應(yīng)，改善胰島功能，達(dá)到降糖降尿酸的作用。此可能是萆苓方降糖降尿酸的機(jī)制之一。

實(shí)驗(yàn)中采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型，成模后各實(shí)驗(yàn)組大鼠較正常組大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿癥狀，且體重明顯低于正常組（P＜0.05或P＜0.01）。藥物治療后3 周，吡格列酮組、萆苓組大鼠“三多”癥狀改善，體重明顯高于模型組（P＜0.05）。說(shuō)明萆苓方可明顯改善糖尿病的臨床癥狀。

相關(guān)分析顯示，高血糖與高血尿酸具有相關(guān)關(guān)系，表明二者之間相互影響，互為危險(xiǎn)因素。與COX-2、PGE2 有顯著相關(guān)性，證實(shí)高血糖、高血尿酸均與炎癥因子有關(guān)，COX-2 及PGE2 參與其中，互為因果，加重了對(duì)機(jī)體的損害。

糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，痛風(fēng)屬中醫(yī)“痹病”“白虎歷節(jié)”范疇，其發(fā)病多與感受外邪、飲食不節(jié)、遺傳等因素有關(guān)，其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛乃脾腎虧虛，臟腑功能衰弱，標(biāo)實(shí)為濕瘀毒互結(jié)，阻滯氣血經(jīng)絡(luò)。萆苓方正是以清熱利濕，瀉濁解毒，活血止痛立法。方中土茯苓、澤瀉、萆薢、薏苡仁利濕瀉濁；威靈仙祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)；黃柏、蒼術(shù)清熱燥濕解毒；當(dāng)歸、虎杖、土鱉蟲活血止痛；懷牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，利關(guān)節(jié)。

綜上所述，本方通過(guò)降低COX-2、PGE2 的高表達(dá)，消除炎癥反應(yīng)，保護(hù)胰島功能，發(fā)揮良好的調(diào)節(jié)血糖、血尿酸、改善糖尿病痛風(fēng)癥狀的作用。