河南省規(guī)模化兔場(chǎng)金黃色葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

郭力偉，朱雪敏，孫新閣

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧業(yè)工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471002；2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一種人獸共患的革蘭陽(yáng)性球菌，其在自然界分布很廣，空氣、水、塵土、飼料及各種物體上都有存在，在家畜的皮膚、腸道、黏膜、扁桃腺等也有寄生，可以引起兔、豬、牛、羊、雞、鴨等多種不同動(dòng)物感染。金黃色葡萄球菌病是一種高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)以致死性敗血癥和組織器官化膿性炎癥為主要特征。該病在兔群內(nèi)傳播快，其單獨(dú)感染檢出率高達(dá)37.6%[1]，給兔健康養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重威脅。感染兔精神不振，食欲減少，腳底皮膚發(fā)生腫脹、破潰[2]；病死兔剖檢肝臟腫大，有明顯的壞死灶，膽囊腫大，膽汁濃稠，脾臟腫大[3]；哺乳母兔的乳房或乳頭感染時(shí)可導(dǎo)致乳房炎，仔兔攝入含該菌的乳汁后可引起黃尿病甚至敗血癥。

金黃色葡萄球菌(S.aureus)廣泛威脅著世界各個(gè)養(yǎng)兔國(guó)家，在我國(guó)流行范圍也較廣，嚴(yán)重影響著我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展，并且一定程度上威脅著人類(lèi)健康。在對(duì)病兔進(jìn)行預(yù)防治療時(shí)，人們往往盲目使用抗菌藥物來(lái)抑制細(xì)菌疾病發(fā)生，逐步加劇了兔病病原菌的耐藥性，使得兔病的治療難以達(dá)到預(yù)期效果。本試驗(yàn)開(kāi)展河南省規(guī)?；脠?chǎng)金黃色葡萄球菌的分離、鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，旨在確定該地區(qū)兔群金黃色葡萄球菌感染情況及相應(yīng)菌株的藥物敏感性，為該地區(qū)規(guī)?；脠?chǎng)金黃色葡萄球菌的分離鑒定與預(yù)防治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2019年10—12月，對(duì)河南省規(guī)?；脠?chǎng)疑似葡萄球菌感染的繁殖母兔，采集4個(gè)兔場(chǎng)繁殖母兔的皮膚膿腫組織，進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)及檢測(cè)。

1.2 主要試劑與儀器 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、藥敏紙片，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PremixTaqTM(E×TaqTMVersion 2.0 plus dye)，購(gòu)自大連TaKaRa公司；溴化乙錠溶液，購(gòu)自蘇州天可貿(mào)易有限公司；細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒、DL-2 000 Marker、Proteinase K，均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(Beckman Coulter)，普通PCR儀(Applied Biosystems 2720)，凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)，電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 細(xì)菌分離純化 采集繁殖母兔皮膚膿腫組織，將采集的樣品劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行涂片，革蘭染色，鏡檢，選擇鏡檢結(jié)果為革蘭陽(yáng)性紫色球菌的菌落進(jìn)一步劃線純化后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 選取GenBank上發(fā)布的金黃色葡萄球菌16S rDNA基因序列，經(jīng)DNASTAR軟件對(duì)比分析后，利用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)金黃色葡萄球菌引物，引物序列見(jiàn)表1。預(yù)擴(kuò)增目的片段大小約為480 bp。引物由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 PCR鑒定

1.5.1 細(xì)菌DNA的提取 取分離純化后的菌液，按照細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行細(xì)菌DNA的抽提。

1.5.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL) PremixTaqTM12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL，上述提取DNA 1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性 4 min后進(jìn)行循環(huán)；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷[4]。抗生素紙片包括：青霉素、紅霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、羧芐西林、哌拉西林、氨芐西林、苯唑西林、克林霉素、萬(wàn)古霉素、麥迪霉素、卡那霉素、頭孢氨芐、頭孢呋辛、頭孢拉定、呋喃唑酮、多黏菌素B、頭孢哌酮。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的形態(tài)特征 將樣品接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，在普通肉湯上生長(zhǎng)迅速，均勻渾濁，管底有少量沉淀，輕輕振蕩，沉淀物上升，隨即消散，不產(chǎn)生菌膜。在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成光滑、濕潤(rùn)、隆起、邊緣整齊、不透明的圓形菌落，放置一段時(shí)間后變?yōu)榻瘘S色(見(jiàn)中插彩版圖1)，麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。涂片進(jìn)行革蘭染色，鏡檢可見(jiàn)大量革蘭陽(yáng)性、短鏈狀或成對(duì)或葡萄串狀的球菌(見(jiàn)中插彩版圖2)。從采集的4個(gè)兔場(chǎng)繁殖母兔組織中共獲得4個(gè)疑似菌株。

圖1 分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng) (200×)Fig.1 Isolation bacteria grow on common agar medium (200×)

圖2 細(xì)菌革蘭染色 (200×)Fig.2 Bacterial gram staining (200×)

2.2 PCR鑒定 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，在病死兔上分離得到的細(xì)菌在約480 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖3)。由PCR鑒定結(jié)果證實(shí)，7只繁殖母兔感染細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。

圖3 細(xì)菌PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of the PCR amplified genes from the bacteria isolatesM:DL-2 000 DNA marker；1：金黃色葡萄球菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M:DL-2 000 DNA marker；1:Staphylococcus aureus 16S rDNA PCR amplification products

2.3 藥敏試驗(yàn) 將金黃色葡萄球菌接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。分離得到的金黃色葡萄球菌菌株對(duì)不同藥物的敏感性見(jiàn)表2。由表2可知，金黃色葡萄球菌對(duì)慶大霉素、羧芐西林、哌拉西林、卡那霉素4種藥物敏感，對(duì)頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢哌酮、青霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、苯唑西林、克林霉素、萬(wàn)古霉素、麥迪霉素、頭孢呋辛、呋喃唑酮、多黏菌素B等多種藥物有不同程度的耐藥性。

表2 不同藥物對(duì)金黃色葡萄球菌菌株的抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of different drugs on Staphylococcus aureus strain

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種非常重要的條件致病菌，能夠引起人和動(dòng)物的局部和全身感染，導(dǎo)致皮膚、軟組織及器官的化膿性炎癥[5-9]。該菌是動(dòng)物體內(nèi)常見(jiàn)細(xì)菌，可以通過(guò)不同的途徑進(jìn)行傳播，正常情況下與動(dòng)物機(jī)體保持一種相對(duì)平衡狀態(tài)，但當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受到環(huán)境條件變化時(shí)，致病菌大量繁殖，常常給動(dòng)物造成嚴(yán)重感染，引起動(dòng)物機(jī)體不同的病理變化。鄧家波等[10]從金絲猴淋巴結(jié)膿液中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染；任美美[11]從患病奶牛子宮分泌物中分離純化得到了金黃色葡萄球菌。

目前，我國(guó)家兔產(chǎn)品產(chǎn)量和兔養(yǎng)殖量均處于世界領(lǐng)先地位[12]。金黃色葡萄球菌病是家兔最常感染的細(xì)菌性疾病之一。Jose等[13]從西班牙不同地區(qū)死兔中分離得到了多株金黃色葡萄球菌；何光志等[14]以食欲不振、皮膚出現(xiàn)乳白色膿腫的野兔為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染是造成野兔皮膚膿腫的主要原因；趙艷春等[15]在發(fā)生乳房紅腫、發(fā)熱、發(fā)硬以及乳房處形成膿腫病癥母兔群中診斷出金黃色葡萄球菌感染；彭正忠等[16]以排黃色尿樣稀糞并有腥臭味、毛色無(wú)光澤而松散、嗜睡的仔兔群為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌是造成仔兔死亡的主要原因。感染金黃色葡萄球菌后，家兔主要表現(xiàn)出乳房炎、皮下膿腫、腳皮炎、仔兔黃尿病等。繁殖母兔感染金黃色葡萄球菌后發(fā)生乳房感染或乳汁帶菌，當(dāng)仔兔允吸感染母兔乳汁后引發(fā)仔兔黃尿病。當(dāng)仔兔感染金黃色葡萄球菌后，發(fā)病 2～3 d就陸續(xù)死亡，死亡率極高。這給我國(guó)兔養(yǎng)殖業(yè)，尤其是仔兔養(yǎng)殖帶來(lái)了極大的威脅。本試驗(yàn)分離菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后，電泳得到大小為480 bp的條帶。與張國(guó)權(quán)等[17]所報(bào)道的獺兔金黃色葡萄球16S rDNA鑒定結(jié)果一致。

根據(jù)金黃色葡萄球菌的流行特點(diǎn)，為有效預(yù)防與控制相應(yīng)感染的發(fā)生，不僅要提高其衛(wèi)生環(huán)境條件，定期清理消毒，而且要提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力，抵抗病原菌的侵襲。臨床上金黃色葡萄球菌易產(chǎn)生耐藥性，很多抗菌素對(duì)其不敏感或效果不好，因此，通過(guò)菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果來(lái)選擇有效的治療藥物十分重要。本次分離得到的4株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，4株菌株均對(duì)慶大霉素、羧芐西林和哌拉西林敏感，其中3株對(duì)卡那霉素敏感，4株菌株對(duì)其他藥物都有不同程度的耐藥性。從本次細(xì)菌耐藥試驗(yàn)結(jié)果分析來(lái)看，河南地區(qū)面對(duì)日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問(wèn)題，必須加強(qiáng)對(duì)抗菌藥物的合理使用，減少細(xì)菌耐藥的發(fā)生。當(dāng)兔場(chǎng)發(fā)生該病時(shí)，應(yīng)通過(guò)藥敏試驗(yàn)科學(xué)選藥，提高治療效果，減少耐藥性產(chǎn)生。