火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC指紋圖譜

陳錦霞，曾杉，林碧珊，陳偉鋼，呂豪輝

國藥集團(tuán) 廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 順德 528303

火麻仁為?？浦参锎舐镃annabissativaL.的干燥成熟果實(shí)[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，性平，味甘。其具有潤腸通便的作用，多用于血虛津虧、腸燥便秘。近代藥理研究表明，火麻仁還具有殺蟲、抗炎、抗血栓形成、抗心律失常、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗?jié)兊茸饔?，有一定的毒性，臨床常用于治療便秘、術(shù)后胃腸功能恢復(fù)、神經(jīng)性皮炎、高血壓等[2-6]。

標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎液。火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑由火麻仁藥材經(jīng)炮制、提取、過濾、濃縮、干燥制備而成。本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)建立了火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的水溶性指紋圖譜和脂溶性成分指紋圖譜，為制定火麻仁配方顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H dass型超高效液相色譜儀(沃特世公司)；MS105DU型十萬分之一天平、萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；Synergy UV型超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)；YMW型機(jī)械分體煎藥壺(深圳一枚王有限公司)。

1.2 試藥

火麻仁對照藥材(批號：121097-201605)、對照品α-亞麻酸(批號：111631-201605，純度：99.8%)、亞油酸(批號：111622-201203，純度：99.8%)均購于中國食品藥品檢定研究院；磷酸、甲酸、乙腈、甲醇為色譜純；乙醇為分析純；水為超純水。

參考《中華人民共和國藥典》2015年版火麻仁項(xiàng)下炮制方法制成火麻仁飲片[1]，藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定，為?？浦参锎舐镃annabissatiraL.的干燥果實(shí)，具體信息見表1。

表1 火麻仁藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

以國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》為依據(jù)，制備火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑。取火麻仁飲片100 g，置于砂鍋中，加水煎煮2次。第一次煎煮加8倍水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30 min，趁熱過200目篩濾過，濾液迅速冷卻，備用；第二次煎煮加飲片量6倍水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁熱過200目篩濾過，濾液迅速冷卻。合并2次濾液，65 ℃減壓濃縮，濃縮至約200 g，冷凍干燥，即得。20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品編號為S1～S20。

2.2 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ

2.2.1色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的CORTECS T3色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸水溶液為流動相B，梯度洗脫(0～5 min，0%A；5～15 min，0%～14%A；15～20 min，14%～90%A；20～20.1 min，90%～0%A)；流速為0.20 mL·min-1；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃。

2.2.2參照物溶液的制備 取火麻仁對照藥材約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流 60 min，放冷，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，5000 r·min-1離心5 min(離心半徑為30 mm)，濾過，即得。

2.2.3供試品溶液的制備 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇水10 mL，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)處理30 min，取出，放冷，用10%甲醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.2.4方法學(xué)考察

2.2.4.1精密度試驗(yàn) 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S13)，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定。分別計(jì)算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(S13)，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣。計(jì)算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品(S13)，分別精密稱取6份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD均少于2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ的建立

2.2.5.120批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ的測定 分別精密吸取2.2.3項(xiàng)下制備的各批次供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

圖1 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ疊加圖

2.2.5.2火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分對照指紋圖譜Ⅰ的建立 采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012版)對20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ進(jìn)行相似度分析，見圖2。以3號峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，見表2～3。結(jié)果表明，20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分對照指紋圖譜Ⅰ相似度較好(>0.9)。

圖2 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ

表2 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ相對保留時間

表3 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ相對峰面積

2.3 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ

2.3.1色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫(0～5 min，0%～25%A；5～10 min，25%～70%A；10～18 min，70%～100%A；18～21 min，100%A；21～21.1 min，100%～0%A)；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為205 nm。

2.3.2參照物溶液的制備 取火麻仁對照藥材約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水10 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流 60 min，取出，放冷，濾過，濾液置水浴蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。另取對照品α-亞麻酸、亞油酸適量，精密稱定，加甲醇制成10 μg·mL-1的混合對照溶液。

2.3.3供試品溶液的制備 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)處理30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.3.4方法學(xué)考察

2.3.4.1精密度試驗(yàn) 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S11)，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定。分別計(jì)算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S11)，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、4、6、8、12、20、24 h進(jìn)樣。計(jì)算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品(S11)，分別精密稱取6份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD均少于2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ的建立

2.3.5.120批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ的測定 分別精密吸取2.3.3項(xiàng)下制備的各批次供試品溶液1 μL，注入液相色譜儀，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3。

圖3 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性指紋圖譜Ⅱ疊加圖

2.3.5.2火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分對照指紋圖譜Ⅱ的建立 采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012版)對20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分UPLC圖譜進(jìn)行處理，自動校正后進(jìn)行色譜法匹配，匹配結(jié)果見圖4。以4號峰亞油酸為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，見表4～5。20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度較好(>0.9)。

注：3.α-亞麻酸；4(S).亞油酸。圖4 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性對照指紋圖譜Ⅱ

表4 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ相對保留時間

表5 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ相對峰面積

3 討論

3.1 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ

3.1.1色譜條件的選擇 采用二極管陣列檢測器(PAD)對樣品進(jìn)行全波長掃描，通過對比不同檢測波長色譜圖發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測波長為254 nm時，火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分色譜峰最多，且各色譜峰的響應(yīng)值均較高，因此選擇254 nm為檢測波長。另考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%甲酸水3種流動相的分離效果，結(jié)果表明，在乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫下，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離度良好。以峰3為參照峰，20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜的其余5個特征峰相對保留時間RSD為0.7%～0.9%，均小于3.0%。

3.1.2水溶性指紋圖譜Ⅰ的評價(jià) 本研究標(biāo)示了火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分的6個共有峰，并通過相似度評價(jià)軟件計(jì)算出20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對照圖譜的相似度，結(jié)果均大于0.90。各批次火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分的圖譜整體上基本一致。

3.2 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ

3.2.1色譜條件的選擇 火麻仁油脂類成分如亞油酸、α-亞麻酸等成分分子結(jié)構(gòu)中僅含有非共軛雙鍵，因此只有末端吸收，在205 nm附近具有較強(qiáng)吸收，因此選擇205 nm作為火麻仁脂溶性指紋圖譜Ⅱ的檢測波長。另考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和甲醇-水3種流動相的分離效果，結(jié)果在乙腈-水梯度洗脫下，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離度良好。以峰4亞油酸為參照峰，20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜的其余3個特征峰相對保留時間RSD為0.2%～0.8%，均小于2.0%。

3.2.2脂溶性指紋圖譜Ⅱ的評價(jià) 本研究標(biāo)示了火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分的4個共有峰，并通過相似度評價(jià)軟件計(jì)算出20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對照圖譜的相似度，結(jié)果均大于0.90。各批次火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分的圖譜整體上基本一致。

上述研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性及脂溶性成分指紋圖譜相似度均較高，說明不同產(chǎn)地火麻仁藥材質(zhì)量差異較?。谎芯拷⒌姆椒ê唵?、重復(fù)性高，為評價(jià)火麻仁藥材質(zhì)量提供了新的方法，并為制定火麻仁配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。