預浸泡-超聲法提取胡蘆巴中薯蕷皂苷元工藝優(yōu)化

魏荷琳，毛霞，南澤東，封家福

樂山職業(yè)技術(shù)學院（樂山 614000）

胡蘆巴是豆科一年生草本植物，又名蘆巴子、香豆子。在我國，胡蘆巴主要產(chǎn)于安徽、河南、四川、新疆、陜西等地，富含有多種有效成分如薯蕷皂苷、有機酸、油脂和色素等，具有很好的滋補和營養(yǎng)功效[1-5]。近年來，雖然就其有效成分的提取分離開展一些研究，然而大部分研究主要集中在提取物的藥理作用方面[6-7]。薯蕷皂苷元作為甾體工業(yè)的一種原料，主要是從薯蕷科植物中提制而得，通常被用來合成一些甾體激素類藥物和避孕藥等，同時還具有抑制癌細胞增殖[8]、肝臟保護[9]和抗糖尿病等功效[10-11]。隨著葫蘆巴種植業(yè)和制膠工業(yè)發(fā)展，人們越來越意識到從制膠后葫蘆巴渣中提取薯蕷皂苷元的重要性和必要性。從葫蘆巴中提取薯蕷皂苷元，通常采用水回流提取法、有機溶劑提取法和酶解法等[5,12]，這些提取工藝直接影響薯蕷皂苷元的純度及產(chǎn)品質(zhì)量[13-14]。

采用預浸泡-超聲法提取工藝，考察浸泡時間、液料比、原料目數(shù)、超聲時間對薯蕷皂苷元提取率的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，以期為葫蘆巴的資源化綜合利用和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器與設(shè)備

1525 EF高效液相色譜儀（美國Waters公司）；501-A型超級恒溫水?。ㄉ虾Ｆ謻|榮豐科學儀器有限公司）；101 A-1電熱鼓風干燥箱（蘇州同福烘箱制造有限公司）；JJ-1定時電動攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；RE-52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海嘉鵬科技公司）；TG 328-A分析天平（沈陽天平儀器有限責任公司）；UT-40超聲波發(fā)生器（廣州蘭泰儀器有限公司）；SHZ-CB立式循環(huán)水真空泵（上海普渡生化科技有限公司）；TG 16臺式高速離心機（北京瑞利分析儀器公司）；JC 517-201/525雙波長紫外檢測器（北京百萬電子科技中心）；WFH-203 B暗箱式三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）。

1.2 主要試劑與藥品

脫膠葫蘆巴豆粉（脫膠率≥25%，楊凌上禾植物科技有限公司）；醋酸鈉（分析純，天津化學試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（分析純，天津化學試劑廠）；薯蕷皂苷元標準品（98%，上海喬羽生物科技有限公司）；纖維素酶（活力單位6萬 u/g，日本Yakult）；氫氧化鈉、乙醇、石油醚、鹽酸、冰乙酸（分析純，西安試劑廠）；甲醇（液相色譜純，天津瑞金特化學品公司）；硫酸（分析純，天津化學試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷元含量測定

2.1.1 HPLC色譜條件

Waters C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱；流動相：甲醇-水溶液，體積比90∶10；柱溫25 ℃；流速1 mL/min；紫外檢測波長206 nm；進樣量20 μ L。

2.1.2 標準品溶液的制備

準確稱取薯蕷皂苷元標準品5.0 mg，用甲醇溶解后放置與5 mL容量瓶中，定容、搖勻即可得1.0 mg/mL的薯蕷皂苷元標準品貯備液。

2.1.3 供試品溶液的制備

準確稱取脫脂后的胡蘆巴粉末20 g加入700 mL水溶液中預浸泡若干小時，在功率300 W、頻率50 kHz的超聲波下提取20 min后濃縮，將其酸濃度調(diào)節(jié)到1.2 mol/L，90 ℃下回流水解5 h，過濾掉酸液，將水解物通過Na2CO3中和水洗至中性，干燥濾餅并加入一定量的石油醚索氏抽提5 h，濃縮提取液稱質(zhì)量并干燥，得到皂苷元樣品，準確稱取該樣品20 g用甲醇溶解，定容搖勻后過濾，即得供試品溶液，備用。

2.1.4 標準曲線的繪制

準確稱取薯蕷皂苷元標準品稀釋并溶解于流動相，制備薯蕷皂苷元系列標準溶液，其薯蕷皂苷元含量分別為0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，0.10和1.2 mg/mL。按照2.1.1色譜條件分別進樣20 μL，以薯蕷皂苷元的峰面積為縱坐標Y，標準溶液的濃度為橫坐標X，得到線性回歸方程：Y=5.573 7×106X-3.221 5×104，R=0.999 9。表明質(zhì)量濃度在0.10～1.2 mg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好。

2.1.5 薯蕷皂苷元提取率的計算

采用外標準法測定，按2.1.1中色譜條件將2.1.3下制備的供試品溶液進樣20 μL，用兩針重復進樣所得數(shù)據(jù)的平均值計算結(jié)果。薯蕷皂苷元提取率可根據(jù)式（1）計算。

式中：V為樣品溶液體積，mL；M為原料中薯蕷皂苷元的總含量，mg；C1為標準溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；S1為標準溶液峰面積，μV·s；S2為樣品溶液峰面積，μV·s。

2.1.6 精密度試驗

取2.1.2配制的1.0 mg/mL薯蕷皂苷元標準品溶液，在2.1.1所述色譜條件下進樣20 μL，重復進樣8次，測定峰面積，求得RSD值為1.03%（n=8），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗

準確稱取薯蕷皂苷元樣品10 g，按照2.1.3供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，分別于0，2，4，6和8 h按2.1.1所述色譜條件進樣20 μL，測定峰面積，求得RSD值為1.29%（n=5），表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復性試驗

按2.1.3供試品溶液的制備方法制備6份樣品溶液，按2.2.1所述色譜條件測定峰面積，求得RSD值為1.56%（n=6），表明該檢測方法重復性比較好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 原料粒度

在浸泡時間4 h、料水比1∶14（g/mL）、超聲時間30 min條件下測定原料粒度對薯蕷皂苷元提取率的影響，結(jié)果見圖1（A）所示。原料粒度較小情況下，薯蕷皂苷元提取率隨目數(shù)增大而提高，40目以后繼續(xù)減小粒度，提取率趨于平緩，且有略微下降趨勢，這是因為原料粒度太大不利于超聲波破壁，從而使得有效成分較難溶出，粒度太小又會使粉碎物料容易凝集，致使濾餅中殘留液較多影響過濾效果，從而導致提取率反而下降。因此實際操作過程中應以40～60目為宜。

2.2.2 料液比

在浸泡時間4 h、原料粒度40目、超聲時間30 min條件下考察料液比對薯蕷皂苷元提取率的影響。結(jié)果如圖1（B）所示。料液比1∶14（g/mL）以下時隨著料液比提高提取率逐漸增加，且增加幅度較大，再繼續(xù)增加料液比，提取率雖然有所增加，但增加幅度較相對小了很多，這是因為料液比過小時容器無法有效潤濕樣品，致使提取率明顯較低，料液比過大又會阻礙超聲波破碎細胞，導致細胞破碎程度下降，從而影響薯蕷皂苷元的提取率。

2.2.3 浸泡時間

在料液比1∶14（g/mL）、原料粒度40目、超聲時間30 min條件下考察浸泡時間對提取率的影響，結(jié)果見圖1（C）所示。預浸泡時間少于6 h時，隨著浸泡時間增加提取率逐漸升高，且在6 h時達到最高值，在6 h以后繼續(xù)增加浸泡時間，提取率開始呈下降趨勢，表明合適的預浸泡時間能有效使溶劑深入到原料細胞內(nèi)部，有利于薯蕷皂苷元提取，但是浸泡時間過長會使得溶液濃度增大，從而致使提取過程中的傳質(zhì)阻力增加，反而對提取效果不利。因此，預浸泡時間6 h左右為宜。

2.2.4 超聲時間

在料液比1∶14（g/mL）、原料粒度40目、浸泡時間4 h條件下考察超聲時間對提取率的影響。結(jié)果見圖1（D），超聲提取時間30 min以內(nèi)，提取率隨超聲時間增加而增大，繼續(xù)增加超過30 min以后，提取率開始下降。因此，超聲時間30 min為宜。

圖1 原料粒度（A）、料液比（B）、浸泡時間（C）和超聲時間（D）對提取率的影響

2.3 響應面分析

2.3.1 因素水平的選取

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇浸泡時間2～10 h、料液比1∶12～1∶18（g/mL）、原料粒度20～100目、超聲時間10～50目，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗原理進行設(shè)計，-alpha、-1、0、+1、+alpha代表自變量水平設(shè)計試驗，表1列出自變量的試驗水平范圍及其編碼。

表1 響應面分析因素與水平

2.3.2 響應面分析方案及結(jié)果

響應面試驗設(shè)計方案及結(jié)果分析見表2，同時利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析及二次多項式回歸擬合，方差分析結(jié)果見表3，擬合得到的回歸方程：薯蕷皂苷元提取率Y=81.99+2.72A+4.79B+2.34C+3.11D-1.12AB-1.26AC+1.83AD-0.56BC+0.41BD+0.36CD-1.08A2-1.40B2-2.73C2-3.89D2。

從表2的數(shù)據(jù)可以看出，試驗值與預測值很接近，表明該模型的適用性很好。從方差分析表3可知，各因素對薯蕷皂苷元提取率影響程度依次為：B（料液比）＞D（超聲時間）＞A（浸泡時間）＞C（原料粒度）。模型p＜0.000 1，失擬差p＞0.05，表明該方程擬合度良好、模型顯著、預測性理想、可應用其優(yōu)化提取工藝。同時，相關(guān)系數(shù)R=0.988 4，驗證實測值與預測值高度相關(guān)。

各因素之間交互作用對提取率的影響可通過響應面曲面較為直觀地反映。薯蕷皂苷元提取率的響應曲面3D圖譜如圖2所示。從圖2可以看出，料液比與超聲時間、超聲時間與浸泡時間、料液比與浸泡時間的交互作用均非常顯著。運用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化所得的預浸泡-超聲法提取葫蘆巴中薯蕷皂苷元最佳工藝為：浸泡時間6.70 h、料液比1∶15.98 g/mL、原料粒度62.4目、超聲時間34.80 min，此時薯蕷皂苷元的提取率為86.89%。

圖2 響應面分析圖

2.4 模型驗證試驗

為驗證該模型的適用性，在優(yōu)化出的最優(yōu)工藝條件下進行3組平行試驗，所得薯蕷皂苷元收率分別為87.36%，85.88%和86.73%，平均收率為86.66%，與模型預測值86.89%基本一致，該模型擬合良好，有良好重現(xiàn)性。

3 討論

通過選取合適參數(shù)水平，考察浸泡時間、料液比、原料粒度和超聲時間對薯蕷皂苷元提取率的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應面分析法對預浸泡-超聲法提取薯蕷皂苷元工藝進行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取工藝條件為：浸泡時間6.70 h、料液比1∶15.98 g/mL、原料粒度62.4目、超聲時間34.80 min。此時薯蕷皂苷元的收率為86.89%，并對模型進行驗證，試驗證明該模型擬合良好，有良好重現(xiàn)性。研究為從胡蘆巴中提取薯蕷皂苷元提供依據(jù)。