線粒體異常與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)

黃慧群，陸浩天，紀(jì)冬梅

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續(xù)發(fā)生兩次或兩次以上的自然流產(chǎn)[1]，育齡期女性發(fā)生率為1%～5%，RSA患者再次妊娠的自然流產(chǎn)發(fā)生率可高達(dá)70%～80%，對(duì)患者的身體狀態(tài)和心理健康都會(huì)造成難以彌補(bǔ)的危害。線粒體存在于絕大多數(shù)真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，其不僅通過氧化磷酸化產(chǎn)生大量ATP，為細(xì)胞的正常生命活動(dòng)提供能量，還參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、鈣離子調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[2]。卵母細(xì)胞是人體內(nèi)線粒體含量最為豐富的細(xì)胞，線粒體為卵子發(fā)生、受精以及胚胎發(fā)育提供能量。據(jù)研究報(bào)道，RSA的發(fā)生可能與線粒體氧化磷酸化功能異常和細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。本文將對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量異常導(dǎo)致的線粒體功能缺陷與RSA發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 線粒體的結(jié)構(gòu)與功能

線粒體是一種普遍存在于除紅細(xì)胞外的真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，含有自身獨(dú)立的遺傳物質(zhì)，即線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。人類mtDNA是16 kb的環(huán)狀雙鏈DNA，包含37個(gè)結(jié)構(gòu)基因：編碼呼吸鏈中的13種蛋白質(zhì)，合成線粒體蛋白質(zhì)所需的2個(gè)核糖體RNA（rRNA）和22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）以及一段非編碼區(qū)即D環(huán)（D-loop），其中D-Loop區(qū)是mtDNA輕鏈和重鏈序列的啟動(dòng)子，主要負(fù)責(zé)調(diào)控mtDNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[4]。MtDNA發(fā)生任何變異都有可能導(dǎo)致線粒體氧化損傷、凋亡和缺氧，從而引發(fā)疾病。

目前發(fā)現(xiàn)的線粒體功能包括：通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP為細(xì)胞提供能量，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜點(diǎn)位并控制細(xì)胞凋亡，維持鈣離子平衡，參與細(xì)胞增殖與細(xì)胞代謝調(diào)控等[3]。線粒體在高能耗過程中（如細(xì)胞的增殖和發(fā)育）發(fā)揮重要作用，這些作用是通過氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP來實(shí)現(xiàn)的。線粒體的氧化呼吸以及調(diào)控細(xì)胞凋亡功能異?？赡苁菍?dǎo)致RSA發(fā)生的主要原因。母系遺傳的線粒體是人類卵母細(xì)胞和早期胚胎中最豐富的細(xì)胞器，其功能異?？缮羁逃绊懧涯讣?xì)胞和早期胚胎ATP的生成水平，進(jìn)而導(dǎo)致染色體異常分離或發(fā)育停滯[3]。有研究也表明卵母細(xì)胞mtDNA的缺失和突變可能會(huì)導(dǎo)致某些不孕婦女和育齡婦女代謝缺陷或復(fù)制障礙[5]。

2 MtDNA異常與RSA

MtDNA出現(xiàn)異常時(shí)，其自我復(fù)制和編碼蛋白的功能出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致線粒體氧化呼吸、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等正常生理功能出現(xiàn)異常，繼而引發(fā)疾病。據(jù)研究報(bào)道，mtDNA的突變和拷貝數(shù)異常與RSA密切相關(guān)。

2.1 MtDNA拷貝數(shù)與RSA MtDNA拷貝數(shù)是指細(xì)胞內(nèi)mtDNA的分子數(shù)量，是細(xì)胞內(nèi)mtDNA水平的一種度量方式，其與ATP的生成和線粒體酶活性等密切相關(guān)，可作為衡量線粒體功能的生物標(biāo)記物[6]。又因?yàn)榫€粒體母系遺傳的特性，加上其易于獲取和檢測(cè)[6]，mtDNA拷貝數(shù)常被用于評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能。

很多研究數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)育異常的受精卵和早期胚胎中，mtDNA拷貝數(shù)明顯降低[7-8]。Murakoshi等[9]進(jìn)行的RSA動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和Desquiret-Dumas等[10]進(jìn)行卵母細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，mtDNA拷貝數(shù)增加可以提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎的生存能力，改善妊娠結(jié)局。有報(bào)道明確指出，mtDNA拷貝數(shù)可能是胚胎存活的重要決定因素，拷貝數(shù)過低可能影響卵母細(xì)胞功能和早期胚胎發(fā)育，導(dǎo)致發(fā)育停滯，引發(fā)RSA[3]。因此推測(cè)，mtDNA拷貝數(shù)低下會(huì)導(dǎo)致線粒體的活性減低、能量生成減少，導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，早期胚胎發(fā)育障礙，誘導(dǎo)RSA的發(fā)生發(fā)展。還有學(xué)者提出了卵母細(xì)胞質(zhì)量的線粒體閾值理論[11]，即人類卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)達(dá)到某一閾值才能確保正常的受精和胚胎發(fā)育，這一閾值是保證線粒體具有一定活性或線粒體能生成所必須的ATP數(shù)量的最低拷貝數(shù)，而任何卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)一旦低于這個(gè)閾值即可導(dǎo)致發(fā)育受損，但目前這一理論還未得到統(tǒng)一認(rèn)可。

然而近幾年來，越來越多的研究都發(fā)現(xiàn)了一個(gè)相反的現(xiàn)象：胚胎細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)升高，胚胎植入率和妊娠率大大降低，胚胎流產(chǎn)率增加[12]。異常升高的mtDNA拷貝數(shù)胚胎植入失敗率甚至達(dá)到100%[13]。對(duì)于這一相對(duì)矛盾的現(xiàn)象，研究者也給出了一些解釋和推測(cè)。Leese[14]提出的“安靜胚胎假說”：正?？纱婊畹呐咛ナ翘幱谝粋€(gè)相對(duì)較低或“安靜”的新陳代謝狀態(tài)，mtDNA拷貝數(shù)較低，而那些發(fā)育潛能降低的胚胎，新陳代謝反而更活躍，mtDNA異常升高。線粒體/mtDNA的一種代償機(jī)制：現(xiàn)有的線粒體功能出現(xiàn)異常，為維持正常的能量供應(yīng)，mtDNA拷貝數(shù)代償性增高[15]。較高的mtDNA拷貝數(shù)可能會(huì)導(dǎo)致其偏離某種穩(wěn)定狀態(tài)和平衡條件，引起非整倍體[16]、化學(xué)誘導(dǎo)應(yīng)激[17]、mtDNA突變[17]等不良后果，繼而導(dǎo)致胚胎植入失敗和流產(chǎn)的發(fā)生。此外，Viotti等[18]還提出一個(gè)令人困惑的問題，線粒體可以包含大量的mtDNA拷貝數(shù)，但mtDNA拷貝數(shù)高并不等于有大量的有功能的線粒體產(chǎn)生。同時(shí)他還指出，線粒體數(shù)量增加也并不一定意味其功能或代謝活動(dòng)增加。

故目前為止關(guān)于mtDNA拷貝數(shù)異常與卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育之間的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議，具體的機(jī)制仍不得而知，mtDNA拷貝數(shù)與RSA相關(guān)性仍需要進(jìn)一步探索與研究。

2.2 MtDNA突變與RSA 線粒體是一種半自主性的細(xì)胞器，自身有一套遺傳物質(zhì)，功能受核DNA與mtDNA的共同調(diào)控，但mtDNA突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核DNA，加之其缺乏良好的保護(hù)和修復(fù)機(jī)制，且暴露于氧化呼吸鏈的應(yīng)激狀態(tài)下，極易因突變而受到損害[15]。MtDNA突變累積到一定程度可導(dǎo)致編碼呼吸鏈相關(guān)蛋白的功能受抑制，mtDNA復(fù)制出現(xiàn)障礙[19]，從而影響線粒體的功能，由于線粒體獨(dú)特的母系遺傳特點(diǎn)，突變累積對(duì)RSA的發(fā)生發(fā)展也會(huì)產(chǎn)生影響。很多研究都顯示，RSA患者的mtDNA突變頻率高于一般的妊娠婦女[3,5,20-21]。例如，Kaare等[3]用變性高效液相色譜法（DHPLC）在RSA患者外周血中就檢測(cè)到19種不同于正常妊娠婦女的mtDNA異質(zhì)性變異；此外，他們還收集并分析了來自RSA患者的8個(gè)胎盤樣品，并發(fā)現(xiàn)胎盤樣品中的mtDNA突變比例比母體更高。這些都提示著mtDNA突變與RSA發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

此外，mtDNA突變累積影響線粒體氧化呼吸功能，造成活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增多，進(jìn)一步加重mtDNA的損傷，導(dǎo)致惡性循環(huán)加速細(xì)胞凋亡，從而引發(fā)RSA[19,22]。當(dāng)mtDNA突變致線粒體氧化磷酸化功能異常時(shí)，ATP生成減少，不能支持卵母細(xì)胞增殖過程中染色體正常分離，導(dǎo)致非整倍體胚胎形成，而非整倍體胚胎是引發(fā)RSA的關(guān)鍵因素之一[23]。

值得一提的是，mtDNA突變本應(yīng)該是隨機(jī)的，可以發(fā)生在任何部位，但最近幾項(xiàng)研究[3,24]發(fā)現(xiàn)，RSA患者中的mtDNA突變更偏愛聚集在非編碼區(qū)的DLOOP和編碼區(qū)的線粒體NADH 脫氫酶亞單位1（MT-ND1）、MT-ND5的區(qū)域，其中以D-LOOP區(qū)突變最為常見。MT-ND1和MT-ND5基因是編碼氧化呼吸鏈的亞基，其突變累積超過一定閾值會(huì)造成線粒體呼吸鏈功能出現(xiàn)異常，并可能影響ATP的生成，形成氧化應(yīng)激而誘發(fā)RSA，有研究表明這些基因突變與RSA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[25-26]。D-LOOP區(qū)調(diào)節(jié)mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，該區(qū)域突變會(huì)影響mtDNA拷貝數(shù)和編碼蛋白的功能，并可能干擾氧化磷酸化功能影響ATP的產(chǎn)生，使卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育能力下降導(dǎo)致流產(chǎn)，亦有文獻(xiàn)報(bào)道D-LOOP區(qū)突變與RSA密切相關(guān)[27-29]。不過以上觀點(diǎn)都仍需要更多的研究來支持和證實(shí)。

3 線粒體氧化磷酸化異常與RSA

3.1 ATP與RSA 線粒體在卵母細(xì)胞和早期胚胎細(xì)胞中的核心作用就是氧化呼吸生成ATP，為正常的卵母細(xì)胞生命活動(dòng)和良好的胚胎發(fā)育提供充足的能量來源[30]。一旦線粒體的氧化呼吸功能出現(xiàn)異常，ATP生成減少，細(xì)胞的能量供需就會(huì)失衡，導(dǎo)致卵母細(xì)胞和早期胚胎的代謝活動(dòng)障礙，也可能引起一系列的發(fā)育異常，如染色體分離障礙，形成非整倍體細(xì)胞；卵母細(xì)胞質(zhì)量下降；細(xì)胞的分裂異常；胚胎植入和發(fā)育失敗等[31]，而這些也是引發(fā)RSA的關(guān)鍵因素。對(duì)ATP含量與卵母細(xì)胞和個(gè)體生育潛能關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠組卵母細(xì)胞和胚胎的ATP含量均明顯高于未妊娠組[32]。另一研究向52周鼠齡的ICR鼠補(bǔ)充可增加卵母細(xì)胞線粒體ATP合成的輔酶后，卵母細(xì)胞數(shù)量和受損卵母細(xì)胞線粒體功能都有明顯提高[33]。上述研究提示ATP生成的減少可能會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

基于這一認(rèn)識(shí)，研究人員也提出了各種方法改善線粒體功能、提高ATP含量，提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎的發(fā)育能力。其中輔酶Q10是一種普遍存在的自由基清除劑，也是線粒體呼吸鏈中產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵成分，目前被提出作為一種補(bǔ)充物改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，可提高妊娠率[34]。Heydarnejad等[35]發(fā)現(xiàn)，在成熟的培養(yǎng)基中添加輔酶Q10可改善線粒體功能，提高ATP含量，增加囊胚形成率和孵化率，提高綿羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。該研究結(jié)果在牛[36]、小鼠[37]等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。但是目前關(guān)于ATP含量對(duì)RSA直接作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)還不充分，基于提高ATP含量的治療方案還有待進(jìn)一步研究。

3.2 ROS與RSA ROS是線粒體經(jīng)氧化代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，生理濃度的ROS是許多細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)劑，起著重要作用，但過量的ROS會(huì)造成細(xì)胞器和大分子物質(zhì)損害，如損害線粒體、水解肽鏈、氧化損傷DNA等，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。而抗氧化物質(zhì)[主要為還原性谷胱甘肽（GSH）]則負(fù)責(zé)還原ROS，因此正常體內(nèi)的活性氧與抗氧化物質(zhì)往往保持動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)線粒體氧化磷酸化異常產(chǎn)生過量ROS時(shí)，正常量GSH無法代償，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而這種氧化應(yīng)激狀態(tài)會(huì)造成卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，胚胎發(fā)育異常，誘發(fā)流產(chǎn)[38]。

很多研究均發(fā)現(xiàn)RSA與ROS以及ROS異常所造成的氧化應(yīng)激密切相關(guān)，比如與正常妊娠婦女相比，RSA患者的細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高；將RSA患者的血漿、全血和胎盤組織與正常妊娠婦女進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)前者的抗氧化物質(zhì)氧化性谷胱甘肽比例（GSH/GSSG）明顯降低，過量的ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，造成RSA[39]。此外，RSA孕婦的男性伴侶常伴有精子質(zhì)量下降，研究表明其內(nèi)分泌功能受損，精子ROS水平升高，DNA受損，而精子DNA在胎盤形成中起關(guān)鍵作用，也可能是導(dǎo)致RSA的關(guān)鍵因素之一[40]。

此外，ROS與RSA的關(guān)系在動(dòng)物試驗(yàn)中也有很大的進(jìn)展。已知秀麗隱桿線蟲存在一種突變體，編號(hào)為mev-1，其假定突變基因位cyt-1（與人類和實(shí)驗(yàn)小鼠SDHC基因同源）的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)ROS水平異常升高，為模擬機(jī)體高ROS水平，Ishii等[41]建立了一組mev-1模擬轉(zhuǎn)基因小鼠，其SDHC突變基因?qū)е吕i氨酸被69位的谷氨酸取代，相當(dāng)于秀麗隱桿線蟲的mev-1突變體。研究表明體內(nèi)高ROS的Tet-mev-1小鼠外周血中血小板數(shù)量明顯增高且脾臟異常腫大，導(dǎo)致平均懷孕13.5 d的Tet-mev-1小鼠容易發(fā)生血栓、胎盤發(fā)炎癥狀從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。此外，Tet-mev-1小鼠的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1（Flt-1）表達(dá)較少，胎盤內(nèi)血管異常增生，表現(xiàn)為胎兒和新生兒常因發(fā)育停滯而死亡[41]。

3.3 細(xì)胞凋亡（線粒體途徑）與RSA 細(xì)胞凋亡即細(xì)胞的一種程序性死亡，是一種生理現(xiàn)象，胎盤絨毛在正常的生長(zhǎng)發(fā)育過程中均離不開其參與。細(xì)胞的內(nèi)在凋亡途徑是其程序性死亡的經(jīng)典形式，而線粒體則是內(nèi)在凋亡途徑的中心，在細(xì)胞凋亡的發(fā)生中發(fā)揮重要且普遍的作用[42]。線粒體途徑的細(xì)胞凋亡主要受到Bax/Bcl-2基因的調(diào)控以及BAK和Bax兩種蛋白介導(dǎo)，BAK和Bax蛋白為促凋亡蛋白，它們被激活會(huì)導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)中，與其他物質(zhì)結(jié)合后形成凋亡小體，進(jìn)而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族，最終介導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[42-43]。相反，Bcl-2蛋白家族具有介導(dǎo)線粒體的完整性和抑制BAK和Bax蛋白的作用，對(duì)細(xì)胞凋亡具有抗凋亡活性[42]。在正常妊娠的情況下，蛻膜組織和胎盤絨毛的細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡之間存在一種平衡[44]。但當(dāng)蛻膜組織中具有抗凋亡活性的基因Bcl-2的表達(dá)明顯降低時(shí)，對(duì)促凋亡的BAK和Bax兩種蛋白表達(dá)的抑制能力也大大降低，線粒體出現(xiàn)異常，激活細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的能力受到干擾，線粒體途徑的細(xì)胞凋亡水平會(huì)明顯升高，細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡也不復(fù)存在，繼而誘導(dǎo)自然流產(chǎn)和RSA等妊娠疾病的發(fā)生。Sun等[44]的研究也發(fā)現(xiàn)RSA患者的滋養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)較普通流產(chǎn)患者有較大變化。例如，RSA患者滋養(yǎng)層細(xì)胞核仁消失，核固縮、裂解，并可見典型的含有線粒體等細(xì)胞器的凋亡小體，呈典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)；其線粒體也出現(xiàn)明顯異常，比如變得腫脹、線粒體鞘減少、排列不規(guī)則，普通流產(chǎn)患者則基本無上述變化。由此可見，線粒體異常所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡也與RSA的發(fā)生有顯著關(guān)系。同時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲也會(huì)受蛻膜組織中過度細(xì)胞凋亡的影響，而滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙又影響到胚胎的植入，最終發(fā)生流產(chǎn)[45]。

4 結(jié)語

以上所述的線粒體功能障礙，mtDNA異常與RSA之間的相關(guān)性都表明了線粒體在RSA發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。相信通過不斷深入探索和研究?jī)烧咧g的關(guān)系，基于線粒體的RSA治療方案亦會(huì)發(fā)揮十分重要的作用，更有效地幫助RSA患者順利獲得健康子代，人類在追求優(yōu)生優(yōu)育的道路上也能更進(jìn)一步！