賴氨酰氧化酶在眼部疾病的研究進(jìn)展

楊 曼，譚 薇，朱曉燕，周海倫，杭 帆

0引言

賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)是細(xì)胞外具有銅結(jié)合部位的氨基氧化酶，可催化膠原蛋白和彈性蛋白之間的交聯(lián)，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。LOX的異常表達(dá)或激活會(huì)改變細(xì)胞的微環(huán)境，導(dǎo)致許多疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化[1]，組織纖維化[2]和癌癥[3]。但是，目前LOX導(dǎo)致疾病發(fā)展的常見變異的潛在機(jī)制仍然未知，但潛在的作用可能在于通過(guò)組織特異性的可變剪接或表達(dá)調(diào)控來(lái)影響LOX的生物學(xué)活性。但無(wú)論是在正?；虿±砬闆r下，關(guān)于眼組織中LOX的信息仍然有限。近年有相關(guān)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)LOX還可能參與多種眼部疾病的病理發(fā)生發(fā)展過(guò)程。因此，本文綜述總結(jié)近年來(lái)LOX在眼部疾病中的研究進(jìn)展，以期為進(jìn)一步研究LOX靶向治療眼部疾病提供幫助。

1賴氨酰氧化酶生物學(xué)特性

1.1賴氨酰氧化酶家族學(xué)者們通過(guò)分子克隆發(fā)現(xiàn)了賴氨酰氧化酶家族(lysyl oxidase family，LOXs)的存在。目前，在哺乳動(dòng)物中已鑒定出五種不同的LOX酶，基于賴氨酰氧化酶基因結(jié)構(gòu)上的同源和相似性，分別命名為賴氨酰氧化酶(LOX)和賴氨酰氧化酶樣蛋白1、2、3以及4(lysyl oxidase like 1, 2,3 and 4, LOXL1,2,3,4)。LOXs的五個(gè)成員的催化結(jié)構(gòu)域是高度保守的，但它們的N端不同。LOX和LOXL1含有一個(gè)N-末端的前肽，而LOXL2、LOXL3和LOXL4的N端由4個(gè)清道夫受體富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域組成。不同的N端序列，可能賦予各自的功能。LOXs具有將膠原蛋白和彈性蛋白中的賴氨酸和羥賴氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性醛的能力[4-5]，所以大量研究已經(jīng)證實(shí)LOXs與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成和/或分解異常有關(guān)，包括心臟的纖維化疾病(心肌纖維化)[6]，脈管系統(tǒng)(動(dòng)脈粥樣硬化)[1]，肺部(肺纖維化)[2]，皮膚(肥厚性瘢痕形成)[7]，腎臟(糖尿病腎病)[8]和肝臟(肝纖維化)[9]。

1.2 LOX的結(jié)構(gòu)和基因背景及生物學(xué)特征LOX也稱為蛋白賴氨酸-6-磷酸酶。人類LOX基因位于染色體5q23.2。LOX合成為包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域的50kDa前蛋白：N末端信號(hào)肽序列(aa1-21-2)，N末端前肽結(jié)構(gòu)域(aa 22-162)和C末端催化結(jié)構(gòu)域(aa 162-417)[10]。LOX可氧化膠原蛋白中的肽基賴氨酸和羥基賴氨酸殘基以及彈性蛋白中的賴氨酸殘基，產(chǎn)生肽基α-氨基己二酸-δ-半醛。這些醛修飾可與鄰肽肽醛或肽賴氨酸的ε-氨基自發(fā)結(jié)合形成穩(wěn)定并導(dǎo)致膠原蛋白和彈性蛋白纖維不溶于ECM的共價(jià)交聯(lián)。LOX通過(guò)膠原蛋白的氧化鍵形成纖維狀ECM的過(guò)程發(fā)生在許多組織類型中(皮膚、軟骨、角膜及某些肌腱等)。多年來(lái)，LOX不僅在ECM的重塑發(fā)揮著重要作用還與細(xì)胞增殖、衰老和趨化、血管重塑、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[3,11-13]。Johnston等[3]通過(guò)對(duì)來(lái)自正常人供體眼球的眼組織中LOX的分布及活性的研究發(fā)現(xiàn)晶狀體、虹膜睫狀體、玻璃體、視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithelium，RPE)，脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜均有LOX的表達(dá)。LOX在眼部組織中主要是介導(dǎo)眼組織中膠原交聯(lián)。也有研究發(fā)現(xiàn)[14]，過(guò)量的LOX水平可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管相關(guān)細(xì)胞凋亡。

2 LOX可能參與的眼部疾病

2.1糖尿病性視網(wǎng)膜病變?cè)谌?，糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)仍然是工作年齡人群視力下降和致盲的首要原因，是嚴(yán)重的不可逆的致盲性眼病[15-16]。其最常見的早期病理特征之一是視網(wǎng)膜微血管病變，如非細(xì)胞性毛細(xì)血管的形成和周細(xì)胞丟失。長(zhǎng)期以來(lái)人們一直認(rèn)為血管基底膜(basement membrane，BM)增厚是糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病變的組織學(xué)標(biāo)志，并可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管細(xì)胞丟失[17-18]。有研究表明，LOX是一種對(duì)基底膜的發(fā)育和成熟至關(guān)重要的交聯(lián)酶，LOX活性增加可能導(dǎo)致過(guò)度的交聯(lián)，從而導(dǎo)致致密的膠原蛋白原纖維，進(jìn)而可能損害基底膜的超微結(jié)構(gòu)完整性[14,19-20]。該研究團(tuán)隊(duì)近年先后通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LOX在高糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)的大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)且過(guò)量的LOX與促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性有關(guān)。LOX過(guò)表達(dá)可能會(huì)通過(guò)降低AKT磷酸化，從而引發(fā)DR相關(guān)的視網(wǎng)膜血管細(xì)胞凋亡。抑制LOX過(guò)表達(dá)可有效阻止視網(wǎng)膜血管細(xì)胞凋亡和糖尿病誘導(dǎo)的LOX過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的視網(wǎng)膜血管細(xì)胞滲漏情況，并通過(guò)建立糖尿病LOX雜合子基因敲除(LOX+/-)小鼠模型證實(shí)了通過(guò)對(duì)大鼠LOX基因敲除可能對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管病變具有保護(hù)作用?？傊?，DR時(shí)，LOX可異常上調(diào)，并可能在促進(jìn)DR相關(guān)的視網(wǎng)膜血管病變的發(fā)展中起重要作用。Subramanian等[21]使用ELISA檢測(cè)評(píng)估玻璃體切除術(shù)中獲得的玻璃體樣品[31例來(lái)自晚期增生性DR(PDR)的患者的玻璃體標(biāo)本和27例非糖尿病患者的玻璃體標(biāo)本]的LOX水平發(fā)現(xiàn)與非糖尿病患者相比患有晚期PDR的糖尿病患者玻璃體中的LOX水平顯著增加。糖尿病組和非糖尿病組在男性和女性受試者之間均未觀察到玻璃體LOX水平的顯著差異。總體而言，當(dāng)前研究的結(jié)果表明視網(wǎng)膜LOX過(guò)表達(dá)可能與DR的發(fā)展有關(guān)。它為進(jìn)一步研究確定抑制LOX過(guò)表達(dá)是否可能是預(yù)防與DR的發(fā)病機(jī)制以及相關(guān)的視網(wǎng)膜血管病變的有用策略提供了基礎(chǔ)。

2.2圓錐角膜圓錐角膜(keratoconus corneas，KC)是一種特征為非炎性進(jìn)行性角膜逐漸變薄和突出，導(dǎo)致不規(guī)則散光和嚴(yán)重的視力障礙的眼病。盡管最近的研究表明與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，但尚不清楚KC的發(fā)病機(jī)制[21-22]。目前假說(shuō)之一是基于膠原纖維的組織和結(jié)構(gòu)的改變。膠原蛋白交聯(lián)提供了在人體大多數(shù)組織(包括角膜)中生理維持細(xì)胞外基質(zhì)所需的機(jī)械強(qiáng)度[23]。LOX可介導(dǎo)膠原蛋白和彈性蛋白原纖維之間共價(jià)鍵的形成，維持角膜的生物力學(xué)特性。Bykhovskaya等[24]在家系中的連鎖和關(guān)聯(lián)結(jié)果以及在兩個(gè)獨(dú)立的病例對(duì)照小組中的正關(guān)聯(lián)研究中確定了LOX基因明顯參與KC的發(fā)病機(jī)制，Hasanian-Langroudi等[25]研究也表明了LOX rs1800449基因型(AA和GA+AA)和等位基因(A)似乎賦予KC易感性風(fēng)險(xiǎn)。Zhang等[26]在高加索人和中國(guó)人的組合數(shù)據(jù)集中確定了LOX變體rs2956540與KC之間的緊密聯(lián)系，并且沒(méi)有異質(zhì)性。他們統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)還表明rs10519694與KC，具有中等異質(zhì)性，這可能是由于潛在的人口差異所致。Dudakova等[27-28]研究發(fā)現(xiàn)，角化圓錐角膜中LOX分布受限，尤其是培養(yǎng)的角膜圓錐形成纖維細(xì)胞中LOX活性降低，他們分析這可能是膠原交聯(lián)不足的潛在原因之一，也是該疾病的標(biāo)志。該研究團(tuán)隊(duì)相繼研究發(fā)現(xiàn)，LOX的分布在約63%的KC患者標(biāo)本中明顯減少，研究數(shù)據(jù)還表明，KC角膜的結(jié)構(gòu)變形可能取決于膠原蛋白和LOX的表達(dá)減少，并通過(guò)相關(guān)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KC患者角膜上皮中的LOX mRNA表達(dá)降低，且與疾病的臨床等級(jí)相關(guān)。在KC患者角膜上皮中LOX活性和蛋白質(zhì)水平均降低。Shetty等[29]也通過(guò)分析KC患者90眼，觀察到KC患者角膜上皮細(xì)胞LOX轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，KC眼淚中LOX活性與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。并通過(guò)免疫組化證明了與健康的供體角膜相比，KC患者上皮中LOX的蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低。綜上均提示KC角膜的結(jié)構(gòu)畸形可能取決于膠原蛋白和LOX的表達(dá)減少。表明LOX在KC發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用。

2.3青光眼青光眼是不可逆的視覺(jué)障礙和失明的主要原因，高眼壓是青光眼最關(guān)鍵的危險(xiǎn)因素，小梁網(wǎng)(trabecular meshwork，TM)組織發(fā)生病理性改變是主要的致病原因，高眼壓與TM內(nèi)ECM沉積增加有關(guān)，并且ECM中有大量突變基因[30]。因此，青光眼可以被視為TM的一種纖維性疾病。早期Sethi等[31]研究發(fā)現(xiàn)，LOX在青光眼患者的TM細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。還說(shuō)明LOX活性增加可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)在TM內(nèi)沉積而導(dǎo)致房水流出阻力增加的原因。Wordinger等[32]最近研究也發(fā)現(xiàn)LOX和LOXL1在TM中有表達(dá)，并且可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β亞型)來(lái)調(diào)節(jié)。該研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)了外源性TGF-β2和gremlin增加了培養(yǎng)的人TM細(xì)胞中交聯(lián)酶的表達(dá)，TGF-β2和gremlin在青光眼TM中的水平升高會(huì)增加LOX，LOXL1的表達(dá)和分泌。隨后由于TM中膠原蛋白和/或彈性纖維的交聯(lián)可增加局部硬度，房水流出阻力和眼壓升高。Sethi等[33]也發(fā)現(xiàn)LOX水平升高可能至少部分導(dǎo)致了小鼠的眼壓升高和房水流出阻力增加，從而導(dǎo)致青光眼。青光眼濾過(guò)手術(shù)(小梁切除術(shù))是治療青光眼的最有效方法，是處理這種致盲疾病的關(guān)鍵程序。但不幸的是，術(shù)后傷口過(guò)度愈合并隨后形成瘢痕，通常會(huì)導(dǎo)致手術(shù)失敗。由于LOXs通過(guò)交聯(lián)膠原蛋白和彈性蛋白在纖維化過(guò)程中起著重要作用，這些酶可能是青光眼手術(shù)中抗纖維化輔助策略的良好靶點(diǎn)候選者。于是Van Bergen等[34]通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)的青光眼手術(shù)兔模型，證實(shí)了兔青光眼小梁切除術(shù)手術(shù)后LOX和LOXL2在Tenon囊和結(jié)膜中均上調(diào)。重要的是，由于LOX和LOXL2的水平早在青光眼手術(shù)后的第3d就被上調(diào)，因此說(shuō)明了這兩種蛋白可能在術(shù)后傷口愈合的早期階段都可能發(fā)揮重要作用。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LOX在青光眼的發(fā)病機(jī)制中及青光眼小梁術(shù)后瘢痕形成中可能發(fā)揮作用。

2.4形覺(jué)剝奪性近視近視是全世界最常見的視力障礙。在過(guò)去的幾十年里，近視的患病率急劇上升，在一些東亞國(guó)家，這種疾病的發(fā)病率高達(dá)80%。來(lái)自臨床研究的強(qiáng)有力證據(jù)表明，與近視相關(guān)的常見結(jié)構(gòu)異常主要是眼軸長(zhǎng)度(axial length，AL)。鞏膜重塑，特別是在眼后極部，已被證明在近視眼軸延長(zhǎng)中起重要作用。Yuan等[35]通過(guò)對(duì)豚鼠近視模型研究發(fā)現(xiàn)近視鞏膜中LOX表達(dá)明顯降低。形覺(jué)剝奪性近視(form-deprivation myopia，F(xiàn)DM)組鞏膜LOX和膠原基因及蛋白水平均顯著低于正常對(duì)照眼組。FDM組膠原纖維直徑較對(duì)照組明顯減小，研究表明實(shí)驗(yàn)性近視鞏膜LOX和Ⅰ型膠原表達(dá)減少。調(diào)節(jié)LOX的表達(dá)可引起膠原纖維的異常堆積和生物力學(xué)強(qiáng)度的改變，提示這種交聯(lián)酶可能在鞏膜重塑過(guò)程中起關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，調(diào)節(jié)鞏膜LOX的表達(dá)可能成為近視的潛在治療靶點(diǎn)。

2.5翼狀胬肉翼狀胬肉是一種起源于角膜緣的翼狀、上皮覆蓋的纖維血管病變，涉及細(xì)胞增殖、遷移、血管生成、纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)重塑。雖然翼狀胬肉的確切病理機(jī)制尚不清楚，但人們認(rèn)為其起源于角膜結(jié)膜形成的慢性紫外線照射引起的角膜緣干細(xì)胞改變[36]。視力損害可能是由于病變向中央角膜遷移引起的散光和視軸阻塞所致。目前，手術(shù)切除仍然是翼狀胬肉的最終治療方法。Pérez-Rico等[37]將翼狀胬肉和正常結(jié)膜樣本根據(jù)年齡(<50/≥50歲)和性別進(jìn)行分組研究發(fā)現(xiàn)分析LOX基因表達(dá)水平，正常對(duì)照結(jié)膜和翼狀胬肉之間的LOX mRNA水平上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異；但按年齡劃分時(shí)，病理老年組的LOX基因表達(dá)高于健康老年結(jié)膜的LOX基因表達(dá)。在分析LOX蛋白表達(dá)時(shí)，不論年齡和性別，病理人群中的LOX表達(dá)均增加。在健康組中，LOX蛋白水平隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，翼狀胬肉老年組的結(jié)締組織中LOX的表達(dá)顯著增加。

2.6原發(fā)性孔源性視網(wǎng)膜脫離視網(wǎng)膜的裂孔導(dǎo)致視網(wǎng)膜下的液體積聚，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與視網(wǎng)膜色素上皮層分離時(shí)，就會(huì)發(fā)生孔源性視網(wǎng)膜脫離(rhegmatogenous retinal detachment，RRD)。在增殖型DR和RRD等玻璃體視網(wǎng)膜疾病中，存在廣泛的ECM重塑。盡管LOX下調(diào)和RRD的機(jī)制尚不清楚，但正常對(duì)照組與RRD患者的玻璃體樣品顯示RRD玻璃體樣品中的LOX活性較低。這種作用可能導(dǎo)致膠原蛋白交聯(lián)不足，導(dǎo)致RRD發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)的變化[13]。Yu等[38]也表明LOX基因多態(tài)性與對(duì)RRD敏感性增加有關(guān)，并暗示了LOX與眼部炎癥之間的潛在相關(guān)性。

2.7年齡相關(guān)性黃斑變性由脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)異常引起的最常見的眼后段致盲疾病是年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)。這種退行性疾病不僅以脈絡(luò)膜新血管形成(choroidal neovascularization，CNV)為特征，而且以黃斑水腫、視網(wǎng)膜退行性變、玻璃體出血和纖維血管瘢痕形成為特征。確實(shí)，導(dǎo)致ARMD失明的主要病理生理過(guò)程是視網(wǎng)膜對(duì)損傷的反應(yīng)，即導(dǎo)致視網(wǎng)膜下纖維化的慢性傷口愈合。纖維化的過(guò)程可能導(dǎo)致周圍組織的破壞，例如感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮的破壞，這可能與永久性視力喪失有關(guān)。由于CNV和纖維化的直接作用，ARMD患者中有10%至15%會(huì)失去中心視力。目前，抗VEGF藥物仍然是治療CNV的金標(biāo)準(zhǔn)。但是抑制血管生成分子不能解決炎癥和纖維化的潛在病理生理過(guò)程。因此，仍然需要治療ARMD的替代策略。Van Bergen等[39]使用激光誘導(dǎo)的ARMD的CNV小鼠模型通過(guò)數(shù)據(jù)表明LOX和LOXL2參與視網(wǎng)膜纖維化的過(guò)程。研究表明LOX和LOXL2在CNV的發(fā)病機(jī)制中起作用。除纖維化外，用抑制性單克隆抗體(AB0023)靶向LOXL2比靶向LOX對(duì)減少血管生成和炎癥具有更廣泛的功效。

3展望

盡管大多數(shù)致盲性眼病與血管滲漏和纖維化引起的眼組織結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)，但關(guān)于LOX參與眼部疾病的信息仍然有限。繼續(xù)進(jìn)一步探索LOX參與的眼部疾病的病理過(guò)程的顯得尤為重要，同時(shí)也為今后LOX靶向治療眼部疾病診治提供新的策略及思路。