系統(tǒng)生物學(xué)方法研究非酒精性脂肪性肝病的基因通路

靳睿 饒慧瑛

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球常見的慢性肝臟疾病[1]。在過去的20年里，人們逐漸意識(shí)到了遺傳因素在NAFLD這種多因素疾病的病因和病程中的作用。研究者通過嚴(yán)格的患者篩選(從家庭和雙胞胎研究中得知的表型變異)、全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)和外顯子測(cè)序等，已在NAFLD的遺傳特點(diǎn)研究方面取得重大進(jìn)展。

早期來(lái)自美國(guó)不同中心的回顧性研究報(bào)道了家族間表型聚集現(xiàn)象，其中受累成員表現(xiàn)出嚴(yán)重的NAFLD疾病特征，包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化[2]。一項(xiàng)橫斷面研究顯示，NAFLD相關(guān)肝硬化患者的先證者(17.9%)出現(xiàn)晚期纖維化的比率是同齡對(duì)照組一級(jí)親屬(1.4%)的12倍[3]。表明遺傳因素在NAFLD病因和進(jìn)展中都起著重要作用。由于NAFLD的復(fù)雜特征是宿主遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，要想全面了解NAFLD發(fā)生涉及的遺傳通路,需要將各種性狀與環(huán)境因素及其他可能與NAFLD特征具有協(xié)同作用的疾病綜合考慮。與肝臟脂肪變性相關(guān)的遺傳性疾病囊括了132個(gè)基因，其中32個(gè)與NAFLD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)?，F(xiàn)介紹調(diào)節(jié)脂滴(LD)生物學(xué)合成、脂肪從頭合成和脂肪酸區(qū)室化以及極低密度脂蛋白(VLDL)的組裝和分泌的途徑和遺傳變異。這些變異在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的因果關(guān)系已通過功能研究和臨床隊(duì)列的廣泛研究得到驗(yàn)證[4]。

一、遺傳變異在LD代謝途徑中的作用

(一)PNPLA3 rs738409C>G單核苷酸多態(tài)性(SNP)編碼Patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域3(PNPLA3)的I148M蛋白變體，在所有人群中占NAFLD遺傳易感性的比例最大，同時(shí)也解釋了種族間疾病易感性的差異[5]。PNPLA3 I148M變體增加了與NAFLD相關(guān)的進(jìn)行性肝損傷易感性，并且是肝病進(jìn)展的一個(gè)常見的修飾因子[6-7]。PNPLA3對(duì)甘油三酯、磷脂和視黃酯存在固有的脂肪酶活性，可介導(dǎo)油酸和其他不飽和脂肪酸(包括花生四烯酸)的水解。當(dāng)野生型蛋白質(zhì)被迅速降解時(shí)，突變蛋白不能泛素化，可在LD表面聚集，同時(shí)改變核心脂質(zhì)的重塑和周轉(zhuǎn)[8]。突變體I148M蛋白作為共顯性負(fù)基因發(fā)揮作用，導(dǎo)致LD水解受損[9]。此外，表達(dá)突變體PNPLA3的肝細(xì)胞表現(xiàn)出自噬功能缺陷和脂肪吞噬能力降低。這些缺陷可促進(jìn)脂肪變性、乳酸堆積和NAFLD發(fā)生[9]。I148M突變體在降低肝星狀細(xì)胞釋放視黃醇的同時(shí)，也降低了LD的豐度，兩者結(jié)合促進(jìn)星狀細(xì)胞活化，導(dǎo)致炎癥、纖維化和癌變。I148M突變體也可能改變脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和脂肪因子的分泌，進(jìn)而影響肝臟的表型[10]。

(二)溶酶體酸性脂肪酶(LAL) 由LIPA基因突變導(dǎo)致的LAL亞型與溶酶體LD轉(zhuǎn)換缺陷和早期中性脂質(zhì)儲(chǔ)存缺陷有關(guān)，由于溶酶體水解缺陷和LD自噬功能受損，促進(jìn)肝臟膽固醇酯和甘油三酯積累，出現(xiàn)嚴(yán)重的NAFLD表型[11]。然而，目前尚不清楚雜合子LIPA攜帶者是否有成人NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)。早期研究表明攜帶者患病率為1∶40 000，而最近對(duì)120個(gè)已知變體的調(diào)查發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率<1∶175 000，表明LAL-D是導(dǎo)致NAFLD的次要原因[12]。

(三)HSD17B13 HSD17B13的最新進(jìn)展進(jìn)一步說(shuō)明了LD重塑在修飾NAFLD表型中的重要作用。在代謝功能障礙或酒精濫用失調(diào)的情況下，編碼位于肝細(xì)胞LDs上的17-β羥類固醇脫氫酶13(HSD17B13)變異與遏制肝炎和纖維進(jìn)展有關(guān)[13-14]。HSD17B13突變減輕肝損傷的主要機(jī)制與改變肝臟脂肪變性本身無(wú)關(guān)，但可能反映了視網(wǎng)膜醇代謝的改變以及纖維化和炎癥途徑的激活，盡管細(xì)胞特異性途徑(巨噬細(xì)胞、星狀細(xì)胞、肝細(xì)胞)尚待闡明[14]?，F(xiàn)有的信息表明,HSD17B13的治療靶點(diǎn)可作為緩解NAFLD進(jìn)展的一種策略。

二、遺傳變異在脂肪從頭合成、脂肪酸的分隔化通路中的作用

脂肪酸(FA)區(qū)隔化用來(lái)反映底物在多個(gè)途徑上的流動(dòng)，包括FA攝取、脂肪從頭合成中的FA流量以及FA在LD水解和重塑過程中的再利用。遺傳學(xué)證據(jù)表明,脂質(zhì)合成途徑與NAFLD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括葡萄糖激酶調(diào)節(jié)因子(GCKR)表達(dá)變異[15]。GCKR通過調(diào)節(jié)葡萄糖流入肝細(xì)胞的量從而調(diào)節(jié)脂肪生成底物的流動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)脂肪從頭合成。大多數(shù)研究都指向一個(gè)共同的SNP(rs1260326)，它能編碼P446L變異，是與脂肪肝相關(guān)的變異。這種氨基酸替換削弱了GCKR對(duì)果糖-6-磷酸的反應(yīng)從而抑制葡萄糖激酶，反映了控制肝臟葡萄糖攝取的負(fù)反饋回路[16]。攜帶P446L-GCKR突變體的受試者伴有循環(huán)中血糖降低和胰島素敏感性增高，但同時(shí)P446L變異體增加了肝臟丙二酰輔酶a的生成，它作為脂肪從頭合成的底物以及阻斷脂肪酸氧化促進(jìn)肝臟甘油三酯的累積，從而促進(jìn)肝臟脂肪變性[16]。

蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3B(PPP1R3B)位點(diǎn)基因變異也被認(rèn)為可以防止肝臟脂肪堆積，該機(jī)制可能是PPP1R3B表達(dá)增加導(dǎo)致過多能量底物向糖原代謝而非脂質(zhì)合成[17]。對(duì)脂質(zhì)重塑在肝病發(fā)病機(jī)制中的重要認(rèn)知來(lái)自全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)，該研究評(píng)估了歐洲隊(duì)列中對(duì)酒精相關(guān)性肝硬化的易感性，強(qiáng)調(diào)了一種接近膜結(jié)合O-?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域7(MBOAT7)位點(diǎn)變異的相關(guān)性[7]。MBOAT7表達(dá)受損會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞和循環(huán)中含有花生四烯酸的磷脂酰肌醇水平降低，且越來(lái)越多的證據(jù)表明，其表達(dá)下調(diào)與肥胖和胰島素抵抗時(shí)NAFLD的發(fā)生有關(guān)，并反映了肝細(xì)胞脂滴中磷脂重塑的改變，特別是溶血磷脂酰肌醇脂質(zhì)[7]。

三、遺傳變異在極低密度脂蛋白(VLDL)組裝和分泌途徑中的作用

肝臟脂質(zhì)輸出在很大程度上取決于脂蛋白的組裝和分泌，該過程從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)開始，然后將LDs從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移到ER內(nèi)腔中。此初始步驟需要腔內(nèi)轉(zhuǎn)移蛋白、微粒體甘油三酸酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTTP)和受體蛋白、載脂蛋白B(APOB)，其突變或缺失可破壞VLDL組裝并導(dǎo)致肝脂肪變性，且伴隨血漿中膽固醇和甘油三酸酯的含量顯著降低。 APOB和MTTP中的遺傳變異分別導(dǎo)致常染色體顯性家族性低血脂蛋白血癥和常染色體隱性無(wú)β-脂蛋白血癥，其代表了NAFLD、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)的罕見遺傳原因[18]。2014年三個(gè)研究小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)了與VLDL組裝和分泌缺陷相關(guān)的導(dǎo)致肝脂肪變性和NAFLD的另一種遺傳原因，即TM6SF2變異。 患有rs58542926突變體TM6SF2(E167K)的受試者表現(xiàn)出等位基因功能缺失，導(dǎo)致VLDL分泌缺陷、LDL水平降低、肝脂肪變性和纖維化[19]。但在整體TM6SF2基因敲除小鼠模型中，VLDL分泌的機(jī)制研究結(jié)果不一致，其中一些研究顯示肝脂肪變性和VLDL分泌減少，而其他研究則表明肝脂質(zhì)無(wú)變化且血清甘油三酯水平無(wú)法解釋的升高[19-20]。矛盾的是， TM6SF2過表達(dá)增加了小鼠的肝脂質(zhì)含量并降低了VLDL分泌。這些研究結(jié)果的差異反映了現(xiàn)在迫切需要了解Tm6sf2在VLDL分泌和肝臟損傷中的作用[20]。

四、系統(tǒng)生物學(xué)方法解釋NAFLD的發(fā)病機(jī)制

在NAFLD中指定單一機(jī)制和(或)單一基因/蛋白質(zhì)的概念(如上所述)已演變成使用系統(tǒng)生物學(xué)方法探索多種因果相互作用的概念。NAFLD代表一系列組織學(xué)表型，具有顯著個(gè)體差異，與代謝綜合征重疊，與其他疾病(肥胖、2型糖尿病)以及多種癌癥具有(基因)多效性。有研究通過無(wú)偏倚的方法來(lái)探討涵蓋數(shù)千種蛋白質(zhì)的多種通路和穩(wěn)態(tài)相互作用，這一過程被稱為NAFLD- Reactome[21]。其研究結(jié)果涵蓋了11種NAFLD-Reactome途徑，包括小分子的運(yùn)輸-特別是“血漿脂蛋白的組裝、重塑和清除”，新陳代謝以及子途徑“能量代謝的整合”，“脂質(zhì)代謝”，“檸檬酸(TCA)循環(huán)和呼吸電子運(yùn)輸”，通過子途徑富集的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)“通過受體酪氨酸激酶進(jìn)行信號(hào)傳遞”，通過子途徑富集的免疫系統(tǒng)“先天免疫系統(tǒng)”和“細(xì)胞因子”系統(tǒng)中的“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”，翻譯后修飾富集的蛋白質(zhì)代謝和“β細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控”。在11種NAFLD-Reactome途徑中，有8種從原始種子列表中確認(rèn)了> 100個(gè)的術(shù)語(yǔ)，包括脂質(zhì)代謝，免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)代謝。這些發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充并擴(kuò)展了以上總結(jié)的遺傳證據(jù)，并提示NAFLD脂質(zhì)代謝改變的其他廣泛影響，包括巨噬細(xì)胞，星狀細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。其研究結(jié)果顯示,新陳代謝節(jié)點(diǎn)(R-HSA-1430728.8)產(chǎn)生的項(xiàng)數(shù)最多，其次是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫系統(tǒng)。以代謝為代表的大節(jié)點(diǎn)還富含“檸檬酸/三羧酸(TCA)循環(huán)和呼吸電子傳遞”等亞途徑，其中包括線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族的成員，如解偶聯(lián)蛋白，參與產(chǎn)熱、脂肪酸代謝，與NAFLD相關(guān)的共病包括肥胖、糖尿病和退行性疾病。TCA循環(huán)和電子傳遞鏈產(chǎn)生的化學(xué)滲透梯度放松調(diào)節(jié)可能對(duì)NAFLD的發(fā)展和嚴(yán)重程度至關(guān)重要[22]。

網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)了免疫系統(tǒng)的一個(gè)節(jié)點(diǎn)，其子通路包括Toll樣受體的調(diào)節(jié)和糖基化終產(chǎn)物受體信號(hào)傳導(dǎo)，與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、腎功能衰竭和衰老有關(guān)。同樣，作為主要囊泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)節(jié)點(diǎn)的一部分，B類受體亞途徑的清除作用被過度強(qiáng)調(diào)，宿主-病原體相互作用和病原體相關(guān)分子模式在NAFLD病理生理學(xué)以及代謝功能和能量平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(RUNX3)的研究結(jié)果引起了人們的興趣，因發(fā)現(xiàn)NASH患者肝臟RUNX3表達(dá)下調(diào)，而酒精性脂肪性肝炎(NASH)中則未見下調(diào)，這是鑒別NAFLD和酒精相關(guān)性脂肪肝的一個(gè)潛在鑒別指標(biāo)[21]。與調(diào)節(jié)β細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的通路與NAFLD高度相關(guān)，尤其是β細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和AKT介導(dǎo)的FOXO1(也稱為FOXO1A)失活有關(guān)。先前的研究表明，F(xiàn)oxO1(FoxO1的小鼠同源物)調(diào)節(jié)肝臟的多種代謝功能，包括糖異生、糖酵解和成脂基因表達(dá)途徑[23]。NAFLD-Reactome途徑證實(shí)了與遺傳性疾病相關(guān)的肝脂肪變性相關(guān)的基因的作用。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了NAFLD通路分析的實(shí)用性，并為遺傳性疾病在確定因果變體和潛在藥理學(xué)目標(biāo)中的作用提供了重要的新見解。

綜上所述，使用分子網(wǎng)絡(luò)推斷NAFLD發(fā)病機(jī)制的途徑存在一些局限，主要是因?yàn)轭A(yù)測(cè)的路徑是使用Pubmed中的現(xiàn)有數(shù)據(jù)構(gòu)建，方法需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。雖然多組學(xué)技術(shù)的可用數(shù)據(jù)支持主要結(jié)論，但預(yù)測(cè)路徑的層次結(jié)構(gòu)也需要正式的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。然而，盡管存在數(shù)據(jù)挖掘的潛在限制，預(yù)測(cè)的NAFLD-Reactome通路為NAFLD的發(fā)展及其進(jìn)展到纖維化和HCC段提供了重要的新線索和見解。