基于HS-SPME-GC/MS指紋圖譜及化學(xué)計量學(xué)的野壩子蜂蜜鑒別

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(1.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,云南昆明 650500; 2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,云南昆明 650106; 3.云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院,云南昆明 650500)

野壩子,又名掃把茶,廣泛應(yīng)用于白族藥、彝族藥等民族藥,其味辛,性涼,具有疏風(fēng)解表、消食化積、清熱利濕等功效[1-6]。野壩子可用于治療風(fēng)寒感冒、腹脹積食、消化不良、腸胃炎腹瀉、潰爛止血等。同時野壩子也是我國西南山區(qū)秋冬期的主要蜜源植物[7-10]。野壩子蜂蜜呈淺綠色、清香濃郁、極易結(jié)晶、結(jié)晶后為乳白色、質(zhì)地堅硬,又稱 “云南硬蜜”,為上等特色蜜,同時具有保健功能,受到市場的廣泛青睞[7-9]。近年來,由于野壩子蜂蜜蜜源較少、蜜價飆升,使得市場出現(xiàn)了大量假冒偽劣產(chǎn)品[10]。目前,國內(nèi)外蜂蜜鑒別技術(shù)主要分為:基礎(chǔ)感官鑒別[11-14],如視覺感官、嗅覺感官、味覺感官;簡單測試鑒別[15-16],根據(jù)簡單反應(yīng)原理加入試劑進行簡單判別;儀器測定鑒別[17-18],如薄層色譜及高效液相色譜及生物顯微鏡檢測,以及近紅外光譜[19]等方法,但采用固相微萃取與氣相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對蜂蜜進行真假鑒別方面的研究未見報道。

固相微萃取(Solid Phase Microextraction,SPME)技術(shù)是20世紀90年代發(fā)展起來的一種樣品分析前處理技術(shù),該技術(shù)集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體,簡便、快速、經(jīng)濟安全、無溶劑、選擇性好、且靈敏度高[20-21]。

本研究采用微固相萃取(SPME)分析技術(shù),結(jié)合指紋圖譜,主成分分析(PCA)、歐氏距離以及聚類分析等化學(xué)計量學(xué)方法,對野壩子蜂蜜與普通蜂蜜、不同產(chǎn)地的野壩子蜂蜜進行了系統(tǒng)研究，以期為市場中野壩子蜂蜜的真?zhèn)舞b別以及產(chǎn)地來源的評價提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂蜜 云南白塔蜂業(yè)有限責(zé)任公司提供(大姚蜂蜜養(yǎng)殖場)不同批次野壩子蜂蜜,經(jīng)鑒定為楚雄大姚野壩子蜂蜜;彌勒蜂蜜 養(yǎng)殖場提供不同批次野壩子蜂蜜,經(jīng)鑒定為紅河彌勒野壩子蜂蜜;不同批次的其他普通蜂蜜Ⅰ和普通蜂蜜Ⅱ 由云南白塔蜂業(yè)有限責(zé)任公司和彌勒蜂蜜養(yǎng)殖場提供;正己烷 色譜純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;氘代甲苯 分析標(biāo)準品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;癸醛 分析標(biāo)準品,百靈威科技有限公司。

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海右一儀器公司;7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;色譜柱 HP-INNOWAX(50 m×0.32 mm×0.25 μm,美國Agilent公司;萃取頭 50/30DVB/CAR/PDMS,美國Supelco公司;CP2245電子天平 德國Sartorius公司;Milli-Q Integral 15超純水儀 德國Merck Millipore DE公司;超聲波清洗器 德國Elma公司;TG16-WS高速離心機 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司;Phenom ProX電鏡 復(fù)納科學(xué)儀器上海有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂蜜花粉孢子學(xué)鑒定 取待分析的兩種野壩子蜂蜜,各稱取10 g,加入50 mL超純水充分溶解后,取出10 mL于15 mL離心管中,放入離心機,8000 r/min離心4 min。倒出上清液,沉淀即為花粉,待花粉自然干燥后,掃描電鏡進行微觀形貌觀察,每個被測樣品隨機選擇10個視野進行觀察,統(tǒng)計花粉粒數(shù)量,確定其種類,以形狀相同數(shù)量最多的某種花粉粒定性。計算公式為:某種花粉粒(%)=10個視野中某種花粉粒個數(shù)/10個視野中花粉粒總數(shù)×100,某種花粉粒數(shù)目大于50%可認定為該種蜂蜜。采用楚雄產(chǎn)成熟期野壩子花粉進行掃描電鏡微觀形貌觀察確定野壩子花粉標(biāo)準圖譜。

1.2.2 樣品處理 分析方法按照文獻所述方法[22-23],共取4種蜂蜜,每種蜂蜜不同批次各取一個樣,取7次,共28個樣。每個蜂蜜樣品準確稱量5 g蜂蜜加入2 mL(30 g/100 mL)食鹽水放置于20 mL棕色頂空瓶中,SPME-GC-MS法測定時加入1 μL的氘代甲苯(正己烷溶)作為內(nèi)標(biāo),隨即旋緊瓶蓋密封待測。

1.2.3 HS-SPME-GC/MS分析

1.2.3.1 儀器條件 固相微萃取條件:萃取溫度:80 ℃,萃取時間:60 min,解吸附時間:30 min;取樣針溫度140 ℃;加熱爐溫度110 ℃;拔針時間0.5 min;操作模式:恒定。氣相色譜[24]:進樣口溫度:250 ℃,分流進樣,載氣:氦氣(99.99%),恒流流速1.0 mL/min,分流比:5∶1,升溫程序:初始溫度50 ℃,保持2 min,升溫速率5 ℃/min至220 ℃,升溫速率10 ℃/min至250 ℃,保持1 min。質(zhì)譜條件:電離方式:EI+;離子源溫度:230 ℃,傳輸線溫度:250 ℃;掃描模式:全掃模式;掃描范圍:40～350 amu;溶劑延遲:3.5 min。

1.2.4 特征性化合物確認 根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果,確定特征性化合物,取癸醛標(biāo)品,配成濃度為10 μg/mL標(biāo)準溶液,采用1.2.3分析方法,對標(biāo)品進行分析,并與蜂蜜樣品進行比對。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Chemmind Chempattern 2017 Pro軟件進行主成分分析(PCA)分析、歐氏距離以及聚類分析。同時采用SIMCA、SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析、Fisher判別,對差異成分進行解析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野壩子花粉孢子學(xué)鑒定

表3 不同蜂蜜HS-SPME-GC/MS數(shù)據(jù)Table 3 HS-SPME-GC/MS date of different honey

為提高分析結(jié)果準確性,確認野壩子蜂蜜來源可靠性,采用電鏡對野壩子花粉蜂蜜進行孢子學(xué)鑒定。野壩子花粉電鏡掃描結(jié)果見圖1,該花粉形態(tài)赤道面觀為長橢圓形,網(wǎng)脊細條紋狀。野壩子蜂蜜鑒定結(jié)果見表1,經(jīng)鑒定,來源于彌勒及大姚的兩種野壩子蜂蜜確為該種蜂蜜,其余兩種普通蜂蜜中野壩子含量分別為5%±0.04%、10%±0.01%,鑒定非野壩子蜂蜜。

圖1 野壩子花粉電鏡掃描圖(1500×)Fig.1 Scanning electron microscopy(SEM)of the Elsholtzia rugulosa Hems L. pollen(1500×) 注:右上圖為局部放大圖(10000×)。

序號蜂蜜種類野壩子花粉占總花粉數(shù)(%)1野壩子蜂蜜(彌勒)62.00±0.032野壩子蜂蜜(大姚)71.00±0.013普通蜂蜜Ⅰ5.00±0.044普通蜂蜜Ⅱ10.00±0.01

2.2 野壩子蜜源產(chǎn)地特征

不同產(chǎn)地的野壩子藥效成分和化學(xué)組成存在明顯差異,從而進一步會對以其為蜜源的野壩子蜂蜜產(chǎn)生重要影響,因此,有必要對其產(chǎn)地進行梳理。表2為本研究所選的兩個野壩子蜂蜜產(chǎn)地的經(jīng)緯度,其中大姚土壤以紅壤和黃壤為主,野壩子產(chǎn)地海拔多為1480～2800 m,pH在5.0～7.9,呈中性偏微酸性,有機質(zhì)為2.0%～4.5%;氣溫低,降雨少,為滇中北部冷涼區(qū)[25-26]。彌勒主要為紅壤,野壩子產(chǎn)地海拔多為1300～2300 m,pH在5.5～7.5,為中性偏微酸性,有機物含量1.2%～3.0%;肥力稍差,熱量條件好,光照充足,為滇中部半干旱區(qū)[25-26]。因此,所選野壩子蜜源產(chǎn)地存在明顯不同,為具有代表性的典型區(qū)域。

表2 野壩子蜂蜜產(chǎn)地經(jīng)緯度Table 2 Longitude and latitude of the Elsholtzia rugulosa Hems L. honey producing areas

2.3 蜂蜜的HS-SPME-GC/MS分析

為了研究蜂蜜揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分,采用HS-SPME-GC/MS對蜂蜜進行了分析。通過與標(biāo)準譜庫的比對檢索,分別鑒定出近60種揮發(fā)性成分,通過數(shù)據(jù)分析處理,結(jié)果如表3所示。四種蜂蜜共檢出64種成分,其中醇類有14種,醛類有11種,酚類1種,烷烴類5種,酸類8種,酯類16種,醚類1種,酮類5種,其他類3種,四種蜂蜜種均為醇類含量最多,醚類及酚類含量最少。彌勒產(chǎn)野壩子蜂蜜中α-異氟爾酮、丁香醇C、丁香醇D、α-甲基苯甲醇為特有成分,大姚產(chǎn)野壩子蜂蜜中γ-丁內(nèi)酯、β-大馬士酮、2-甲基萘、間苯二甲醛、月桂酸為特有成分,普通蜂蜜Ⅱ中對甲苯甲醚、茴香醛、對甲氧基苯乙酸乙酯、十八酸乙酯為特有成分,普通蜂蜜Ⅰ無特有成分。

續(xù)表

注:-:表示未檢出。

2.4 不同蜂蜜指紋圖譜分析及特征性化合物確認

在蜂蜜的HS-SPME-GC/MS數(shù)據(jù)中,以內(nèi)標(biāo)回收率最好的樣品為基數(shù),其他樣品的內(nèi)標(biāo)峰面積與基數(shù)進行相比,得到這個比值為加權(quán)系數(shù)。利用公式:加權(quán)峰面積=原始積分峰面積/加權(quán)系數(shù),對峰面積進行量化。將HS-SPME-GC/MS數(shù)據(jù)以CDF格式依次導(dǎo)入Chemmind Chempattern 2017 Pro專業(yè)版軟件,按照以上方法量化各樣品的峰面積,確定得到15個共有峰,建立蜂蜜樣品的共有模式,

表4 不同蜂蜜的歐氏距離Table 4 Euclidean distances for different kinds of honey

注:表格中“-”表示離群數(shù)據(jù)已排除。

建立蜂蜜樣品的化學(xué)指紋圖譜疊加圖,結(jié)果如圖2所示。以四種蜂蜜所有色譜圖建立共有模式,得到一個指紋圖譜及15個共有峰,其共有峰對應(yīng)的化學(xué)成分通過檢索指認如圖3所示。通過對蜂蜜化學(xué)指紋圖譜[27-28]疊加圖比對研究,結(jié)果表明在該分析方法下野壩子蜂蜜與普通蜂蜜的特征差異化學(xué)成分為癸醛和苯乙酸,可以作為野壩子區(qū)別普通蜂蜜的特征化學(xué)成分。并對特征性化合物進行確認,分析結(jié)果顯示:癸醛標(biāo)準品保留時間為19.701 min,定性離子:112/57；苯乙酸標(biāo)準品保留時間為46.243 min，定性離子：136/91。野壩子蜂蜜(彌勒)保留時間為19.698 min,野壩子蜂蜜(大姚)保留時間為19.702 min時對應(yīng)出峰位置均出現(xiàn)定性離子(112/57),說明該化合物為癸醛；野壩子蜂蜜(彌勒)中苯乙酸保留時間為46.240 min，野壩子蜂蜜(大姚)中苯乙酸保留時間為46.245 min時對應(yīng)出峰位置均出現(xiàn)定性離子(136/91)，說明該化合物為苯乙酸。

圖2 蜂蜜的HS-SPME-GC/MS疊加圖Fig.2 Stacking chromatograms of honey’s HS-SPME-GC/MS 注:右上圖為局部放大圖。

圖3 蜂蜜的指紋圖譜及其共有峰Fig.3 Honey’s fingerprint and its common peak 注:1.乙醇;2.反式氧化芳樟醇;3.順式氧化芳樟醇; 4.壬酸乙酯;5.脫氫芳樟醇;6.苯乙醇; 7.辛酸;8.三乙酸甘油酯;9.壬酸;10. 棕櫚酸乙酯; 11.2,4-二甲基苯乙酮;12.癸酸; 13.二十三烷;14.苯甲酸;15.油酸乙酯。

圖4 不同蜂蜜的主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis of different honey

2.5 不同蜂蜜的主成分分析

為了直觀地對不同蜂蜜進行區(qū)分,將HS-GC/MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件ChemPattern 2017 Pro,進行主成分分析。如圖4所示,為不同蜂蜜的主成分分析圖。圖中X軸為每個樣品的第一主成分得分,Y軸為每個樣品的第二主成分得分。第一主成分貢獻率為88.43%,第二主成分貢獻率為7.24%,其總貢獻率為95.67%,接近100%,表明1類主成分對所有指標(biāo)的代表性較強。兩個野壩子蜂蜜位置接近,同時與普通蜂蜜可以明顯分開,具有較好的區(qū)分效果。表明2 個產(chǎn)地的野壩子蜂蜜揮發(fā)性成分具有大量的共有成分,而與普通蜂蜜揮發(fā)性成分的組分和含量上存在明顯的差異性。因此,可以利用SPME-GC/MS結(jié)合PCA主成分分析對野壩子蜂蜜進行真?zhèn)舞b別。

2.6 不同蜂蜜的歐氏距離及聚類分析

歐氏距離的大小與其相似程度相關(guān),通常相似度越大的樣本其歐氏距離接近,且歸為一類的可能性越大。表4為不同蜂蜜的歐氏距離數(shù)據(jù),由表4可知,野壩子蜂蜜的歐氏距離為0.42～0.49,與所選的普通蜂蜜的歐氏距離區(qū)別明顯。

聚類分析是一種根據(jù)樣本的相似程度進行歸類的方法,目前在中草藥材質(zhì)量評價、產(chǎn)地品種分類、真?zhèn)舞b別等方面應(yīng)用廣泛。它是根據(jù)觀察值或變量之間的相似程度,將最為相似的樣品結(jié)合在一起,以逐次聚合的方式將樣品聚類,直到最后所有樣品都聚成一類。一般臨界值越小,表明樣品越相似。將HS-GC/MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件ChemPattern 2017 Pro,對蜂蜜樣品進行系統(tǒng)聚類分析,所得結(jié)果如圖5所示。臨界值處于7.0～10.0時,四類蜂蜜可以明顯進行區(qū)分,臨界值10.0～10.5時,整個蜂蜜樣品可以分為兩類,即野壩子蜂蜜和普通蜂蜜。

圖5 不同蜂蜜的聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of different kinds of honey

歐氏距離、聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致,表明野壩子蜂蜜與普通蜂蜜揮發(fā)性成分具有明顯差異,其結(jié)果對野壩子蜂蜜與普通蜂蜜真?zhèn)舞b別具有一定的指導(dǎo)性作用。

2.7 野壩子蜂蜜的Fisher判別

表7 驗證樣本與重心的距離計算值及判別結(jié)果Table 7 The calculated value of the distance between the validation sample and the center of mass and results of discrimination

上述研究表明野壩子蜂蜜與普通蜂蜜存在明顯的區(qū)別,為了對野壩子蜂蜜與普通蜂蜜進行進一步區(qū)別,通過篩選特定化學(xué)成分作為指標(biāo),構(gòu)建Fisher函數(shù)實現(xiàn)野壩子蜂蜜的類別判別。其基本思想是先根據(jù)類間距離最大、類內(nèi)距離最小的原則確定線性判別函數(shù),再用此函數(shù)判定待判樣品的類別判別[29]。

選擇SPME-GC-MS圖譜中的15 個共有峰的面積為變量,建立四種蜂蜜的 Fisher 判別函數(shù)。在 27 個蜂蜜樣品中(7個彌勒野壩子蜂蜜,7個大姚野壩子蜂蜜,7個普通蜂蜜Ⅰ,6個普通蜂蜜Ⅱ),隨機抽取的 5 份樣品(S3,S9,S12,S19和S25)為驗證樣本;其余 22 份蜂蜜樣品為模型樣本,進行 SPSS 判別分析。使用逐步判別篩選對判斷分類有明顯作用的變量,篩選出的變量為:X2(反式氧化芳樟醇)、X3(順式氧化芳樟醇)、X4(壬酸乙酯)、X5(脫氫芳樟醇)、X6(苯乙醇)。對應(yīng)的22 份蜂蜜已知樣品的非標(biāo)準化 Fisher 判別函數(shù)為:

Z1=3.943+0.746X2-1.234X3-0.796X4+0.064X5+0.038X6(方差解釋率61.0%)

Z2=-2.594+2.535X2-5.009X3-0.073X4-0.032X5+0.017X6(方差解釋率37.4%)

Z3=-5.254+1.438X2-3.376X3+0.349X4+0.084X5+0.009X6(方差解釋率1.6%)

將上述5份蜂蜜驗證樣本的5個共有成分代入Fisher判別函數(shù)計算,計算結(jié)果見表5;組質(zhì)心處的函數(shù)見表6,反映各類別在空間坐標(biāo)中的位置,并計算分別離各重心的距離,其距離計算值與某種蜂蜜重心距離最近數(shù)值最小者可判別為該種蜂蜜,以此為判別依據(jù)對五個驗證樣本進行分類,結(jié)果如表7所示。該判別結(jié)果與實際情況相符,符合率達100%。

表5 驗證樣本的判別函數(shù)值Table 5 Discriminant function value of validation samples

表6 組質(zhì)心處的函數(shù)Table 6 Functions at the center of mass of the group

2.8 不同產(chǎn)地野壩子蜂蜜的差異成分研究

上述PCA、歐氏距離、聚類分析以及Fisher類別判定研究表明,野壩子蜂蜜與普通蜂蜜存在明顯差異,同時兩個代表性產(chǎn)地的野壩子蜂蜜也存在一定差異。為了實現(xiàn)不同產(chǎn)地野壩子蜂蜜的識別及質(zhì)量控制,對云南省兩個代表性野壩子蜂蜜產(chǎn)地野壩子蜂蜜差異成分進行研究,采用顯著性P值對其差異成分進行研究。將HS-GC/MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA軟件,計算不同揮發(fā)性成分的P值,結(jié)果如表3所示。當(dāng)P<0.05時,認為其有顯著性差異,通過對表3的P值分析,表明化學(xué)成分丁香醇C、間苯二甲醛、丁香醇D等42個成分存在顯著差異(P<0.05)。說明2個代表性產(chǎn)地野壩子蜂蜜成分差異明顯,風(fēng)格差別顯著,這可能與其產(chǎn)地特征差異所造成的。其中丁香醇C、間苯二甲醛、丁香醇D、月桂酸乙酯、α-異氟爾酮、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、異丁醇、2-甲基丁醇等9個成分的F值較大,可作為2個代表性產(chǎn)地野壩子蜂蜜樣品間的主要差異成分。

3 結(jié)論

野壩子蜂蜜作為具有保健功能的云南特色優(yōu)質(zhì)蜂蜜,市場上假冒偽劣產(chǎn)品較多。本研究首次采用HS-SPME-GC/MS檢測結(jié)合化學(xué)計量學(xué)數(shù)據(jù)分析手段,根據(jù)其共有指紋圖譜進行篩選出癸醛和苯乙酸為野壩子蜂蜜的特征物質(zhì),同時對四種蜂蜜作PCA及聚類分析,并根據(jù)指紋圖譜所確定共有色譜峰構(gòu)建Fisher函數(shù)作為判別依據(jù),實現(xiàn)了野壩子蜂蜜與普通蜂蜜快速準確鑒別,一種檢測手段結(jié)合多種數(shù)據(jù)分析方法同時鑒別,其結(jié)果可進行相互驗證,對特征物質(zhì)選擇及野壩子蜂蜜與普通蜂蜜真?zhèn)舞b別具有一定的指導(dǎo)性作用。同時,采用F檢驗進行分析,表明2個代表性產(chǎn)地野壩子蜂蜜成分差異明顯,同時對差異性成分進行分析,這可能是由于產(chǎn)地特征差異造成的。本實驗不僅實現(xiàn)了野壩子蜂蜜的鑒別,而且提高了不同種蜂蜜或不同產(chǎn)地同種蜂蜜的鑒別準確性,為不同產(chǎn)地野壩子蜂蜜來源產(chǎn)地識別及質(zhì)量控制的評價提供技術(shù)支持。