SGK1抑制劑EMD638683對(duì)膀胱出口梗阻小鼠腎組織細(xì)胞焦亡的作用及機(jī)制研究

曾琦紋， 陳 林， 邢莎莎， 許 歡， 張亞美， 劉 迅， 楊德華

(1成都大學(xué)， 四川 成都 610106； 成都大學(xué)附屬醫(yī)院 2泌尿外科， 3中心實(shí)驗(yàn)室， 4藥物臨床試驗(yàn)中心， 四川 成都 610081)

后尿道瓣膜(posterior urethral valves, PUV)是先天性梗阻性腎病的常見原因，可導(dǎo)致不同程度的膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)[1]，而25%～50%的患者在到達(dá)成人時(shí)會(huì)發(fā)展為終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)[2]。梗阻性腎病以炎癥反應(yīng)為基本特征，具有較高的發(fā)病率和死亡率[3]。前期研究中，研究者在小鼠BOO模型中觀察到腎小管炎性損傷[4]。但是，BOO模型導(dǎo)致腎臟損傷的機(jī)制不清楚。已經(jīng)證實(shí)炎癥反應(yīng)在腎臟損傷中發(fā)揮著重要作用，是導(dǎo)致慢性炎癥損傷的關(guān)鍵機(jī)制[3]。NLRP3炎癥小體是一種關(guān)鍵的復(fù)合蛋白，與腎臟損傷密不可分，它主要激活caspase-1，活化的caspase-1進(jìn)一步促進(jìn)炎性因子 IL-1β 和 IL-18 的切割和成熟從而導(dǎo)致炎癥[5]。細(xì)胞焦亡是一種促炎性細(xì)胞死亡，其在梗阻性腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。NLRP3、caspase-1和IL-1β是腎臟細(xì)胞焦亡路徑的關(guān)鍵因子，gasdermin D (GSDMD)是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子[6]，即NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的激活促使成熟的IL-1β等炎性因子產(chǎn)生增多，而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡發(fā)生。研究報(bào)道，血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1(serum and glucocorticoid-regulated kinase 1, SGK1)抑制劑EMD638683通過(guò)阻斷NLRP3炎癥小體激活來(lái)減弱小鼠心臟炎癥和纖維化[7]。SGK1是絲氨酸/蘇氨酸激酶基因家族的成員，在各種生理和病理生理中起重要作用[8]，并且研究者在梗阻性腎病中觀察到SGK1的過(guò)量表達(dá)[9]。以上研究表明，SGK1抑制劑EMD638683可能是通過(guò)調(diào)控NLRP3/caspase-1/pyroptosis信號(hào)通路，抑制caspase-1介導(dǎo)的炎性損傷而拮抗細(xì)胞焦亡。本實(shí)驗(yàn)采用BOO模型研究小鼠下尿路梗阻介導(dǎo)的腎臟炎性損傷；同時(shí)，EMD638683干預(yù)經(jīng)醛固酮(aldosterone,ALD)處理的小鼠腎小管上皮細(xì)胞，初步探討SGK1對(duì)小鼠腎小管上皮細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠19只，體重(20±2) g，購(gòu)于成都達(dá)碩生物科技有限公司，合格證號(hào)SCXK(川)2015-030。所有小鼠被飼養(yǎng)在12 h晝夜交替的環(huán)境中，且飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(20±2) ℃，濕度為(50±2)%。實(shí)驗(yàn)前，所有小鼠進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以保證小鼠的狀態(tài)穩(wěn)定。

1.2細(xì)胞 小鼠腎小管上皮細(xì)胞(mouse renal tubular epithelial cells, mRTECs)購(gòu)于豪地華拓生物科技有限公司，貨號(hào)為HTX2460。

1.3藥物和試劑 醛固酮購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；EMD638683購(gòu)自MedChemExpress；抗β-actin和F4/80抗體購(gòu)自武漢三鷹公司；抗NLRP3、caspase-1和SGK1抗體購(gòu)自Abcam；抗IL-1β和gasdermin D-N末端片段(gasdermin D N-terminal fragment, GSDMD-N)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；小鼠IL-1β酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco。

2 方法

2.1動(dòng)物模型制備和分組 6～8周雌性BALB/c小鼠，按照標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)條件飼養(yǎng)，自由進(jìn)食與飲水，每籠3～4只。動(dòng)物模型的制備參照Chen等[4]，新型膀胱出口梗阻造模方法即尿道外口縫合法。選取19只小鼠隨機(jī)分為4組，正常(control,Ctr)組4只，模型(BOO)組共15只，梗阻時(shí)間1周、2周和3周各5只。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 小鼠腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃，飽和濕度，5% CO2的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞的融合率達(dá)到85%時(shí)，傳代。根據(jù)文獻(xiàn)[10]，設(shè)置醛固酮濃度梯度分別為0、1、5、10和20 μmol/L，用含有1%的FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞總蛋白或上清。待ALD濃度確定后，設(shè)置EMD638683濃度為50 μmol/L[7]，細(xì)胞分為正常(Ctr)組、造模(ALD)組和治療(ALD+EMD638683)組，培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞總蛋白或上清。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2.3HE染色 腎組織用4%的多聚甲醛溶液固定，乙醇逐級(jí)脫水，石蠟包埋，塊切成5 μm厚的切片并用HE染色,高倍鏡觀察腎組織病理改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2.4PAS染色 腎臟石蠟切片進(jìn)行脫蠟，高碘酸、Schiff試劑和蘇木素染色，無(wú)水乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，高倍倒置顯微鏡下觀察腎臟組織病理性形態(tài)學(xué)變化并采集圖像。

2.5Masson染色 腎臟石蠟切片進(jìn)行脫蠟，重鉻酸鉀、蘇木素、麗春紅、磷鉬酸和苯胺藍(lán)染色，無(wú)水乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，高倍倒置顯微鏡下觀察腎臟組織病理性形態(tài)學(xué)變化并采集圖像。

2.6免疫組織化學(xué)染色 腎臟石蠟切片進(jìn)行脫蠟，檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液抗原修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活和5%BSA室溫封閉30 min。與Ⅰ抗[抗NLRP3(1∶200)，抗SGK1(1∶100)，抗caspase-1(1∶200)，抗F4/80(1∶200)，抗IL-1β(1∶100)]孵育過(guò)夜，相應(yīng)Ⅱ抗37 ℃恒溫孵育30 min，DAB染色和細(xì)胞核復(fù)染，中性樹膠封片。高倍倒置顯微鏡下觀察腎臟組織病理性形態(tài)學(xué)變化并采集圖像。Image-Pro Plus軟件測(cè)量陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域。

2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 從腎臟組織和培養(yǎng)的細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)樣品。在10%SDS-PAGE分離相等濃度的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含有5%脫脂牛奶的TBS-Tween(0.1%)封閉膜1 h，隨后，將膜與抗NLRP3(1∶1 000)、抗SGK1(1∶1 000)、抗caspase-1(1∶1 000)、抗GSDMD(1∶1 000)和抗 β-actin(1∶1 000，內(nèi)參照)在4 ℃孵育過(guò)夜。用 TBST緩沖液洗滌膜后，與相應(yīng)的Ⅱ抗室溫孵育1 h，脫色搖床上TBST緩沖液中洗滌5次，每次8 min。將化學(xué)發(fā)光底物(chemiluminescent substrate)中的A液和B液等體積混合，覆蓋住PVDF膜約2 min后進(jìn)行顯影。置于蛋白印跡成像系統(tǒng)的顯影平臺(tái)上進(jìn)行顯影成像，保存圖像。使用Image-Pro Plus軟件檢測(cè)灰度值，將數(shù)據(jù)針對(duì)β-actin標(biāo)準(zhǔn)化。

2.8酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法 根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用小鼠IL-1β ELISA試劑盒測(cè)試細(xì)胞上清液中IL-1β的濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)，至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。使用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠腎臟組織形態(tài)的比較

HE染色顯示，正常組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)基本正常，腎間質(zhì)偶見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；隨著小鼠的梗阻時(shí)間(1、2和3周)的增加，小鼠腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增多，與正常組比較，梗阻3周[BOO (3 w)]組小鼠腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，腎小管上皮細(xì)胞變性，濁腫。通過(guò)PAS染色，與正常組比較，BOO (3 w)組觀察到受損的腎小管(黑色箭頭)。通過(guò)Masson染色評(píng)估BOO誘導(dǎo)的腎纖維化，正常組小鼠腎間質(zhì)中沒(méi)有膠原沉積，BOO (1 w)和BOO (2 w)組小鼠腎間質(zhì)偶見膠原沉積(藍(lán)色染色)，與正常組比較，BOO (3 w)組腎間質(zhì)膠原沉積明顯增多。這3種染色的顯微照片見圖1。

Figure 1. The morphologial changes of the mouse kidney tissues in different groups. The scale bars=50 μm. Black arrows indicate renal tubular injury in HE and PAS staining, and collagen deposition in Masson staining.

圖1 各組小鼠腎臟組織形態(tài)的比較

2 小鼠腎組織F4/80表達(dá)比較

正常組小鼠腎臟僅見少量F4/80陽(yáng)性表達(dá)；與正常組比較，BOO (3 w)組 F4/80陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域顯著升高(P<0.01),見圖2。

Figure 2. F4/80 expression in the mouse kidney tissues detected by immunohistochemistry. The scale bars=50 μm. Brown areas show the expression of F4/80 protein. Mean±SEM.n=4 in Ctr group;n=5 in BOO (3 w) group.**P<0.01vsCtr group.

圖2 小鼠腎組織F4/80表達(dá)比較

3 小鼠腎臟SGK1、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)比較

免疫組化法檢測(cè)腎切片中相關(guān)蛋白的表達(dá)，正常組腎臟組織中SGK1、NLRP3、caspase-1和IL-1β呈弱表達(dá)，BOO (3 w)組SGK1、NLRP3、IL-1β和caspase-1主要在腎小管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，IL-1β在腎小管細(xì)胞間質(zhì)中也有表達(dá)。與正常組小鼠比較，BOO (3 w)組腎組織中SGK1、NLRP3、caspase-1和IL-1β表達(dá)顯著升高(P<0.01),見圖3。

Figure 3. The expression of SGK1, NLRP3, caspase-1 and IL-1β proteins in the mouse kidney tissues detected by immunohistoche-mistry. The scale bars=50 μm. Brown areas show the expression of the above proteins. Mean±SEM.n=4 in Ctr group;n=5 in BOO (3 w) group.**P<0.01vsCtr group.

圖3 小鼠腎臟SGK1、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)比較

Western blot法檢測(cè)腎皮質(zhì)中相關(guān)蛋白的表達(dá)，BOO (3 w)組小鼠腎組織SGK1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N和IL-1β蛋白表達(dá)顯著高于正常組(P<0.05或P<0.01),見圖4。

Figure 4. The expression of SGK1， NLRP3， caspase-1， GSDMD-N and IL-1β proteins in the mouse kidney tissues detected by Western blot using β-actin as internal reference. Mean±SEM.n=4 in Ctr group;n=5 in BOO (3 w) group.*P<0.05，**P<0.01vsCtr group.

圖4 小鼠腎臟SGK1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N和IL-1β蛋白表達(dá)比較

4 不同濃度醛固酮誘導(dǎo)的mRTEC中SGK1、NLRP3及caspase-1蛋白表達(dá)比較

mRTECs經(jīng)不同濃度醛固酮刺激后，SGK1、NLRP3及caspase-1 蛋白表達(dá)均增加。與正常組比較，經(jīng)1、5和10 μmol/L濃度醛固酮刺激的mRTECs中SGK1、NLRP3及caspase-1 蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；經(jīng)20 μmol/L濃度醛固酮刺激的mRTECs中SGK1、NLRP3及caspase-1表達(dá)較正常組無(wú)顯著差異,見圖5。

5 不同濃度醛固酮誘導(dǎo)的mRTECs上清液中IL-1β含量

ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β的水平，結(jié)果顯示，用1、5、10和20 μmol/L濃度醛固酮刺激的mRTECs IL-1β分泌水平顯著高于正常組(P<0.01)，見圖6。因此，我們使用經(jīng)1 μmol/L醛固酮處理的mRTECs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6 EMD638683對(duì)mRTECs NLRP3-caspase-1-pyroptosis信號(hào)通路的影響

與正常組和ALD+EMD638683治療組比較，ALD組SGK1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N和IL-1β蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；ALD+EMD638683治療組SGK1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N和IL-1β表達(dá)與正常組比較無(wú)顯著差異,見圖7、8。

討 論

梗阻性腎病是腎衰竭的一個(gè)重要原因，其基本特征是腎臟的炎癥反應(yīng)[10]。而炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)許多腎臟疾病(急性腎損傷和慢性腎臟疾病)發(fā)展的基礎(chǔ)[11]。本項(xiàng)工作建立小鼠BOO模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，隨著小鼠梗阻時(shí)間的增加，小鼠腎臟腎小管細(xì)胞變形和濁腫、腎間質(zhì)的糖原沉積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是逐漸加重的，即腎臟炎性損傷隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步加深；同時(shí)與正常小鼠比較，梗阻3周小鼠中F4/80陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域顯著增多，表明梗阻3周小鼠中腎組織損傷加重而引起巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加。細(xì)胞焦亡是一種伴隨著炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡，兼具凋亡和壞死的特征又有別于之[12]。本研究中，炎癥相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β在梗阻3周的小鼠中表達(dá)顯著高于正常小鼠；且陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域主要是在腎臟腎小管細(xì)胞。同時(shí)，腎臟GSDMD-N在梗阻3周的小鼠中表達(dá)也顯著多于正常小鼠，即梗阻性腎病引起腎臟炎癥反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞焦亡也參與梗阻性腎病引起的腎損傷。

Figure 5. The expression of SGK1, NLRP3 and caspase-1 proteins in mRTECs induced by different concentrations of ALD detected by Western blot using β-actin as internal reference. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsCtr group.

圖5 不同濃度醛固酮誘導(dǎo)的mRTECs中SGK1、NLRP3及caspase-1 蛋白表達(dá)比較

Figure 6. The IL-1β levels in supernatants of mRTECs induced by different concentrations of ALD detected by ELISA. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsCtr group.

圖6 不同濃度ALD誘導(dǎo)的mRTECs上清液中IL-1β含量

當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，NLRP3炎癥小體激活導(dǎo)致caspase-1的成熟[13-14]，活化的caspase-1再激活下游 IL-1β和IL-18前體，同時(shí)切割GSDMD膜蛋白[15-16]，使細(xì)胞膜破裂，引起炎癥因子(IL-1β、 IL-18)和溶酶體等細(xì)胞內(nèi)容物釋放，從而導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]?？偟膩?lái)說(shuō)，NLRP3的激活導(dǎo)致caspase-1的成熟[18]，其介導(dǎo)細(xì)胞焦亡[19-20]并調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子如IL-1β和IL-18的切割和成熟[21]。近年來(lái)研究證實(shí)NLRP3炎癥小體參與腎臟炎性損傷[3]。NLRP3/caspase-1/IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的組織損傷是導(dǎo)致慢性梗阻性腎病進(jìn)展為終末期腎病的重要因素[22]。目前，對(duì)細(xì)胞焦亡在腎臟炎性損傷中作用的研究尚缺乏。本研究構(gòu)建了小鼠BOO模型，分析了該模型引起的下尿路梗阻介導(dǎo)的腎臟炎性損傷與細(xì)胞焦亡有一定的聯(lián)系。由此提示，靶向調(diào)控NLRP3-caspase-1-pyroptosis信號(hào)通路,可抑制caspase-1介導(dǎo)炎性損傷而拮抗細(xì)胞焦亡，從而發(fā)揮治療梗阻性腎病的潛力。

EMD638683是一種高選擇性SGK1抑制劑，其響應(yīng)各種刺激并介導(dǎo)許多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。在多種疾病中觀察到過(guò)量的SGK1表達(dá)，包括肺纖維化、糖尿病腎病、腎小球腎炎、梗阻性腎病和肝硬化[7]，且過(guò)量的SGK1表達(dá)與炎癥反應(yīng)相關(guān)[23]。本研究我們也觀察到梗阻3周小鼠腎臟中SGK1的表達(dá)顯著高于正常小鼠，并且SGK1表達(dá)主要分布于腎臟腎小管細(xì)胞中。SGK1是NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵蛋白[8]，主要通過(guò)下調(diào)NLRP3炎癥小體激活來(lái)起作用。實(shí)驗(yàn)采用醛固酮誘導(dǎo)mRTECs炎癥反應(yīng)，炎癥相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β都顯著增多，同時(shí)SGK1的表達(dá)也顯著增加。但隨著EMD638683的干預(yù)，SGK1的表達(dá)被顯著抑制，同時(shí)炎癥相關(guān)蛋白和GSDMD-N也被顯著抑制，表明EMD638683可能通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的重組來(lái)抑制caspase-1的活性,阻斷caspase-1切割I(lǐng)L-1β和 GSDMD膜蛋白，提示SGK1通過(guò)調(diào)控NLRP3炎癥小體活化，而介導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)和焦亡引起的腎損傷。

Figure 7. Effect of EMD638683 on NLRP3-caspase-1-pyroptosis signaling pathway in mRTECs detected by Western blot using β-actin as internal reference. Mean±SEM.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsCtr group；▲P<0.05，▲▲P<0.01vsALD group.

圖7 EMD638683對(duì)mRTEC中NLRP3-caspase-1-pyroptosis信號(hào)通路的影響

Figure 8. Effect of EMD638683 on the secretion of IL-1β protein in mRTECs detected by ELISA. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsCtr group；▲▲P<0.01vsALD group.

圖8 EMD638683對(duì)mRTEC細(xì)胞IL-1β蛋白分泌的影響

本研究表明，小鼠BOO模型引起下尿路梗阻介導(dǎo)的腎臟炎性損傷，同時(shí)也觀察到SGK1的表達(dá)顯著增加，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)，即SGK1與腎臟炎性損傷有密切關(guān)系。SGK1抑制劑EMD638683能通過(guò)減輕醛固酮誘導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)而達(dá)到保護(hù)腎臟的作用。EMD638683通過(guò)抑制NLRP3-caspase-1-pyroptosis信號(hào)通路而減輕醛固酮誘導(dǎo)的腎臟炎癥。