miR-219靶基因HLA-G與胚胎停止發(fā)育相關(guān)性研究

張瑩 王敏 李江紅

【摘 要】目的：探討miRNA219靶基因HLA-G在胚胎停止發(fā)育中的表達(dá)及意義。方法：應(yīng)用免疫組化LDP法以及Envision〔TM〕系統(tǒng)（K4001）（Dako公司產(chǎn)品）檢測(cè)135例胚胎停育婦女（實(shí)驗(yàn)組）及65例正常早孕人工流產(chǎn)婦女（對(duì)照組）絨毛組織中的HLA-G。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)在胚胎停育絨毛組織中，HLA-G低表達(dá)。而在正常流產(chǎn)絨毛組織中，HLA-G高表達(dá)。通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、組織芯片免疫組化檢測(cè)通過(guò)上調(diào)miR-219的水平，能夠在24h內(nèi)迅速降低HLA-G的表達(dá)。結(jié)論：本研究通過(guò)對(duì)200例絨毛組織中的HLA一G蛋白的檢測(cè)，證實(shí)了在絨毛組織中，HLA-G起著關(guān)鍵的作用。觀察發(fā)現(xiàn)，miR-219和HLA-G的表達(dá)之間成負(fù)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】miRNA219HLA-G;表達(dá)負(fù)相關(guān)胚胎停止發(fā)育

【中圖分類號(hào)】R714【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2020）01--02

人類白細(xì)胞抗原-G（human leukocyte antigen-G，HLA-G）是1987年首次克隆出來(lái)的位于6號(hào)染色體短臂的一類免疫耐受分子[1]，具有選擇性組織分布的特點(diǎn)，其選擇性高表達(dá)于侵入子宮蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞，而此處恰恰不表達(dá)經(jīng)典的HLA-A，B分子及DR，DQ和DP分子.在絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，包括那些侵入子宮蛻膜的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中HLA-G高表達(dá);而在胎盤絨毛的合體滋養(yǎng)層中，HLA-G表達(dá)水平較低.絨毛膜細(xì)胞滋養(yǎng)層與絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)層的分化伴隨著細(xì)胞表面HLA-G分子表達(dá)水平的提高。

胚胎停止發(fā)育又稱稽留流產(chǎn)，是指胎兒或者胚胎組織已死亡滯留宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出者，表現(xiàn)為有或無(wú)任何癥狀，早孕的反應(yīng)消失，子宮不再增大反而縮小。B型超聲檢查提示妊娠囊形態(tài)異常，無(wú)胎心搏動(dòng)[2]。導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育的原因十分復(fù)雜，目前已知的病因中有遺傳因素、生殖道結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌失調(diào)，細(xì)胞增殖和凋亡的失衡，免疫功能異常，全身感染性疾病、強(qiáng)烈應(yīng)激與不良習(xí)慣，環(huán)境污染、食品安全、輻射和長(zhǎng)期暴露于有毒化學(xué)物質(zhì)環(huán)境以及孕婦高齡等[3]。但仍有超過(guò)50% 的胚胎停止發(fā)育原因不明。隨著二胎政策放開(kāi)，近幾年來(lái)臨床工作中胚胎停止發(fā)育的發(fā)生及發(fā)展呈不斷上升的趨勢(shì)，目前迫切需要尋找與之密切相關(guān)的診斷位點(diǎn)對(duì)于其臨床診斷和治療有著十分重要的意義。

近年來(lái)研究[4]提示，miRNA 在稽留流產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用。而且有大量的研究表明[5，6]，在胚胎干細(xì)胞、著床后胚胎等過(guò)程中均有 mi RNA 的表達(dá)，例如R-125a，miR-295，miR-181b及miR-219等等都與胚胎發(fā)育有關(guān)。前期我們?cè)鴳?yīng)用：RT-PCR檢測(cè)表明 ，胚停育組miRNA219表達(dá)明顯高于對(duì)照組.為此，我們進(jìn)一步研究了miRNA-219在稽留流產(chǎn)中的表達(dá)和功能、相關(guān)靶基因以了解其之間的相關(guān)性。

我們通過(guò)TargetScan軟件對(duì)miR-219靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并結(jié)合一些文獻(xiàn)查閱，在多個(gè)潛在的靶基因中選取了HLA-G進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。

在進(jìn)一步的研究中，我們旨在調(diào)查 HLA-G在臨床胚胎停止發(fā)育的絨毛組織和正常流產(chǎn)的絨毛組織中的表達(dá)水平，進(jìn)而進(jìn)一步檢測(cè)胚胎停止發(fā)育患者絨毛組織中miRNA219的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 方法

實(shí)驗(yàn)組：選取2016年7月至2017年7月于濰坊市婦幼保健院產(chǎn)科及計(jì)劃生育科就診的135例胚胎停止發(fā)育（年齡24～46歲，年齡中位數(shù)為34.3歲）的患者，孕7～12周， 平均孕10周， 既往身體健康， 無(wú)子宮肌瘤、卵巢囊腫、子宮形態(tài)異常、慢性感染等生殖器官疾病。胚停育的診斷標(biāo)準(zhǔn)：B超提示（1）妊娠囊不增長(zhǎng)、變形， 輪廓模糊， 小于妊娠月份;（2）胚芽枯萎縮小或無(wú)心血管搏動(dòng)[7]， 經(jīng)1周后復(fù)查無(wú)改變。

對(duì)照組：同期隨機(jī)抽取孕7～12周要求人工流產(chǎn)者65例，年齡21～44歲， 平均32.2歲， 既往無(wú)不良孕產(chǎn)史， 無(wú)其他婦產(chǎn)科合并癥。見(jiàn)表1。

兩組孕婦在年齡、孕周、生育史等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05），具有可比性。

1.2 標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均采用負(fù)壓吸宮法， 無(wú)菌操作取部分絨毛，用免疫組化LDP法以及Envision〔TM〕系統(tǒng)（K4001）（Dako公司產(chǎn)品）分別從胎停育絨毛組織和正常絨毛組織中提取HLA-G，以觀察其在兩組中的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件包（IBM SPSS Statistics數(shù)據(jù)編輯器19）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以 ?表示，兩組間比較采用 t 檢驗(yàn)，多組間采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

我們發(fā)現(xiàn)在胚胎停育絨毛組織中，HLA-G低表達(dá)。而在正常流產(chǎn)絨毛組織中，HLA-G高表達(dá)。前期我們進(jìn)行了miR219在兩組組織中的研究，發(fā)現(xiàn)在胚胎停育組miR219高表達(dá)。通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、組織芯片免疫組化檢測(cè)通過(guò)上調(diào) miR-219的水平，能夠在24h 內(nèi)迅速降低HLA-G的表達(dá)，這說(shuō)明 miR-219對(duì) HLA-G 有著明顯的調(diào)控作用。

討論

本研究通過(guò)對(duì)200例絨毛組織中的HLA-G蛋白的檢測(cè)，證實(shí)了在絨毛組織中，HLA-G起著關(guān)鍵的作用。觀察發(fā)現(xiàn)，miR-219和HLA-G的表達(dá)之間成負(fù)相關(guān)。HLA-G作為一種非經(jīng)典 HLA-I 類分子，在母-胎免疫耐受及維持正常妊娠中起重要的免疫調(diào)節(jié)作用[8-9]。HLA-G 分子主要存在于絨毛遠(yuǎn)端的細(xì)胞滋養(yǎng)層。其通過(guò)與免疫活性細(xì)胞（如殺傷性 T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等）和有關(guān)因子如 IL-2等發(fā)生作用，阻斷母體對(duì)胎兒的免疫應(yīng)答，保護(hù)妊娠順利進(jìn)行。在胚胎著床期間，子宮蛻膜有大量浸潤(rùn)的免疫活性細(xì)胞，其中大多數(shù)是 NK 細(xì)胞，而HLA-G 能抑制 NK 細(xì)胞的殺傷活性。因此，HLA-G 的減少可能使滋養(yǎng)細(xì)胞易受母體免疫系統(tǒng)攻擊，影響著床和妊娠維持，從而導(dǎo)致妊娠的失敗。通過(guò)我們的研究，我們希望揭示miR-219在臨床應(yīng)用方面的價(jià)值。我們的研究將為設(shè)計(jì)針對(duì)miR-219的靶向藥物提供充分、可靠的理論依據(jù)，為解決患者今后的胚胎質(zhì)量提供新思路，以達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。

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