單細胞分析在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究進展

王諳 吳琦 陳懷永

天津醫(yī)科大學(xué)海河臨床學(xué)院 天津市肺臟再生醫(yī)學(xué)重點實驗室300350

呼吸系統(tǒng)疾病病死率在世界范圍內(nèi)逐年上升,每年約有700多萬人死于呼吸系統(tǒng)疾病［1］。這些疾病通常是細胞內(nèi)在突變、細胞間作用改變、對環(huán)境損害的異常應(yīng)答、細胞類型比例失調(diào)以及組織結(jié)構(gòu)紊亂的綜合結(jié)果［2］。已有報道稱,肺中存在40余種細胞類型［3］。最近有關(guān)學(xué)者在人類氣道壁上發(fā)現(xiàn)了一種豐度很低的新型上皮細胞類型——離子細胞［4］,這得益于單細胞測序技術(shù)強大的分析功能。單細胞測序技術(shù)通過轉(zhuǎn)錄組擴增進行高通量測序,揭示單個細胞的基因表達狀態(tài),反映細胞間的異質(zhì)性和動態(tài)互作,把組織病理學(xué)推向單細胞水平［2］。全面而深入地解析人類肺組織及呼吸系統(tǒng)疾病模型動物肺臟所有細胞類型、功能和互作關(guān)系,有助于人們理解肺臟功能的基本原理,揭示呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生與發(fā)展的機制。

1 單細胞測序技術(shù)

作為單細胞系統(tǒng)生物學(xué)的一部分,單細胞測序的原理是將分離的單個細胞的微量遺傳基因進行擴增,獲得高覆蓋率的完整的基因組后,再進行高通量測序,用于揭示細胞群體差異和細胞進化的關(guān)系。單細胞測序已成為檢測細胞間基因異質(zhì)性的重要工具,它將計算科學(xué)、數(shù)學(xué)模型和高通量技術(shù)與細胞的生物學(xué)功能結(jié)合起來［5］。2002年,多項研究報道單細胞轉(zhuǎn)錄組的基因芯片分析［6-9］。雖然基因芯片使全面分析單細胞轉(zhuǎn)錄組成為可能,但是它只能檢測已知基因,而且檢測的靈敏度和動態(tài)范圍均有限［10］。2009年,Tang等［11］通過對小鼠的單個卵母細胞進行分析,首次報道單細胞轉(zhuǎn)錄組的深度測序分析 (single cell RNAsequencing,scRNA-Seq)。2012 年,Wang 等［12］通 過 單 細胞測序的方法,測定100個精子的重組率,發(fā)現(xiàn)許多新的重組熱點。2013年,Ni等［13］首次利用癌癥患者外周血單個循環(huán)腫瘤細胞進行全基因組和外顯子組測序,為腫瘤無創(chuàng)診斷和監(jiān)測提供了一種新的技術(shù)手段。單細胞測序技術(shù)能夠解析細胞間更加細微的差異,推動腫瘤、微生物、神經(jīng)科學(xué)、免疫等領(lǐng)域的發(fā)展,正在成為生命科學(xué)研究中的熱點［14］。從2016 年開始,scRNA-Seq技術(shù)被逐漸引入到呼吸系統(tǒng)疾病研究中來。

2 單細胞分析在肺發(fā)育研究中的應(yīng)用

對肺臟功能的研究中,單細胞測序技術(shù)有助于解析肺臟發(fā)生過程中的細胞進程,定義間充質(zhì)、上皮和單核/巨噬細胞群體之間的細胞異質(zhì)性。Treutlein等［15］利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析小鼠遠端肺細胞類型。對198個不同分化階段的小鼠肺上皮細胞進行聚類分析,能有效區(qū)分遠端肺上皮細胞的各個類型,并發(fā)現(xiàn)了上皮細胞的多個新標志物。重建了雙潛能前體細胞沿2個肺泡譜系成熟的步驟,闡明了Ⅱ型肺泡上皮細胞譜系發(fā)生過程。Lee等［16］使用了基因譜系追蹤、單細胞RNA 測序和類器官培養(yǎng)等技術(shù),在小鼠肺中鑒定出2個支持上皮干細胞生長的間質(zhì)細胞群。這兩群間質(zhì)細胞分別表達Lgr5 和Lgr6,分布的部位也不相同。這種對上皮細胞和其鄰近間質(zhì)細胞之間譜系特異性的鑒定,拓寬了人們對肺臟細胞組成及其互作的理解。Wang等［17］利用scRNA-seq技術(shù),確定出生后Ⅰ型肺泡上皮細胞(alveolar typeⅠ,AT1)的發(fā)育特點。發(fā)現(xiàn)成體AT1細胞群中同時含有Hopx+Igfbp2+和Hopx+Igfbp2-2個AT1細胞亞群,且其中Igfbp2+的AT1細胞比例在肺泡形成和肺切除后新形成的肺泡中增加,其在肺臟穩(wěn)態(tài)及肺通氣功能中的作用有待進一步揭示。

3 單細胞分析在呼吸系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用

3.1 單細胞分析與肺癌 肺癌的異質(zhì)性被認為是設(shè)計和選擇個體化治療策略,以及重新定義腫瘤病理學(xué)分子類別的關(guān)鍵 線 索,并 用 于 精 準 醫(yī) 學(xué) 治 療［18］。Kim 等［19］應(yīng) 用scRNA-Seq檢測單個腫瘤內(nèi)的基因表達和單核苷酸突變的全面信息,并從肺腺癌患者的異種移植物中分離出34個來源于患者的異種移植物腫瘤細胞,在這些細胞中鑒定出一個與抗癌藥物耐藥相關(guān)的候選腫瘤細胞亞群,有助于優(yōu)化臨床抗腫瘤策略。然而,人們更多關(guān)注的是,癌細胞的基因序列是否會在體內(nèi)生長過程或體外培養(yǎng)過程中發(fā)生改變［20］?；颊邆€體差異、原發(fā)或轉(zhuǎn)移、癌變部位以及治療方法等因素帶來的腫瘤細胞微環(huán)境的異質(zhì)性也會影響單細胞內(nèi)基因表達的動態(tài)變化［21］。另外,靶向或非靶向藥物本身也可直接或間接改變微環(huán)境發(fā)揮藥理學(xué)作用,而微環(huán)境改變導(dǎo)致體細胞基因突變以及細胞對治療的敏感性改變,這也是在治療過程中產(chǎn)生耐藥性的潛在機制之一。Suzuki等［22］通過構(gòu)建和篩選scRNA-Seq文庫,測量了肺腺癌細胞系中每個細胞對分子靶向藥物反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組特征,以及原始細胞和細胞獲得耐藥性后的差異。Guo等［23］通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序,檢測了14例非小細胞肺癌患者在進行藥物治療之前,其外周血、癌旁組織和癌組織中的T 細胞,描述了在不同T 細胞亞群中一些已知的免疫治療靶點基因的表達分布,揭示了不同的免疫治療藥物可能對應(yīng)的靶向細胞,為非小細胞肺癌患者未來的精準治療提供了支持。

3.2 單細胞分析與肺纖維化 氣道重塑、炎癥、肺泡破壞和蜂窩狀肺被認為是肺纖維化的重要特征之一,肺纖維化是慢性肺疾病中病死率和發(fā)病率較高的疾病之一［24］。上皮修復(fù)是肺損傷后愈合的一個持續(xù)過程,在此過程中,上皮細胞遷移至損傷部位,分泌細胞因子促進自我增殖和分化,產(chǎn)生新的上皮細胞類型［4］。Xu等［25］通過scRNA-Seq分析基因表達的差異,定義了特發(fā)性肺纖維化動物模型中不同的上皮細胞類型,并追蹤了慢性肺損傷修復(fù)過程中氣道上皮細胞增殖分化的過程。scRNA-Seq分析可以確定許多與細胞亞型特異性相關(guān)或與疾病特異性相關(guān)的上皮細胞標志物,但由于臨床活檢、倫理以及技術(shù)障礙的限制,測量慢性肺疾病患者的單個上皮細胞分布是一個實際的挑戰(zhàn)［19］。3.3 單細胞分析與哮喘 人類的肺臟能夠與外界進行有效的氣體交換,同時也通過黏膜免疫來抵御病原體的入侵而發(fā)揮屏障作用。肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)依賴于結(jié)構(gòu)細胞和免疫細胞之間密切的相互作用［26］。Vieira Braga等［27］收集并檢測來自健康人以及哮喘患者的肺臟細胞,包括上呼吸道和下呼吸道細胞以及肺實質(zhì)部位的細胞。研究人員在健康者中發(fā)現(xiàn)了肺部記憶性T 細胞,并在哮喘患者的肺部發(fā)現(xiàn)了新的黏液纖毛細胞和杯狀細胞,這些細胞似乎有助于下呼吸道增生。除此之外,還發(fā)現(xiàn)了上皮內(nèi)肥大細胞、致病性2型輔助性T 細胞。通常來說,各種細胞應(yīng)該密切聯(lián)系,以保持呼吸道的正常功能,但對于哮喘患者來說,這種細胞間的相互作用幾乎不存在,而由炎性細胞取代。

4 單細胞研究的局限性

雖然目前單細胞測序技術(shù)在基礎(chǔ)研究和臨床研究中都得到了廣泛的應(yīng)用,但仍存在一些困難需要克服。最明顯的困難之一就是需要將組織樣本制成單細胞懸液。對于液體活檢來說,如支氣管肺泡灌洗液或外周血,制成單細胞懸液通常只需要原始活檢樣本的濃縮;而對于實體組織檢查來說,從細胞外間質(zhì)組織相互連接的細胞中分離出單個細胞的過程便更加困難,酶消化和機械消化的步驟是必不可少的,需要精確的方案和原始組織來源［28］。另外,在分離過程中,某些操作可能會給細胞帶來影響,這些影響包括改變細胞的轉(zhuǎn)錄、表達以及代謝過程。因此,需要建立合適的單細胞制備技術(shù),從而反映細胞體內(nèi)的真實情況。

5 單細胞分析技術(shù)在呼吸系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用前景

生物個體中,不同組織器官中、同一組織器官中處于不同周期階段的細胞都必須協(xié)同而又有差別地程序性開啟或關(guān)閉某些基因,以便執(zhí)行正確的生物學(xué)功能。在臨床醫(yī)學(xué)中,從微觀水平上,觀察單個細胞的動態(tài)變化,以及避開細胞的異質(zhì)性,區(qū)分病變組織中正常細胞和病態(tài)細胞的生理狀態(tài),全面揭示病理學(xué)的改變,甚至發(fā)現(xiàn)一些新出現(xiàn)的豐度低的功能細胞,這些對于疾病的診斷和治療都非常重要。單細胞分析技術(shù)為回答這些重要的問題提供了有效的分析技術(shù)與方法,未來還可以利用單細胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多新類型的細胞,深入了解疾病的發(fā)病機制,甚至鑒別出在癌癥或者疾病早期起關(guān)鍵作用的細胞及標志物,以這些標志物為指導(dǎo)進行疾病的預(yù)防、診斷,并可以根據(jù)此來研究新的治療方式和藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突