γ干擾素釋放試驗在終末期腎病合并肺結(jié)核患者中的應用研究

呂培 何紅彥 賀向紅 郭丹 王永

1河北省胸科醫(yī)院心腎內(nèi)科,石家莊050041;2河北省胸科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,石家莊050041;3河北省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科,石家莊050041

目前,結(jié)核病在全球的發(fā)病率較高,嚴重威脅著人類的生命健康,其屬于一種比較常見的傳染病。根據(jù)相關(guān)研究,在全世界的60億人中,約有20億人感染了結(jié)核桿菌,并且每年新增800萬～1 000萬例結(jié)核病患者,嚴重地危害著人類健康和生命安全［1-2］。終末期腎病患者由于免疫功能低下,且存在營養(yǎng)不良、貧血等,是結(jié)核高發(fā)人群,結(jié)核病患病率高于普通人群7.5～25倍［3］,病死率亦高于普通人群,結(jié)核菌主要通過呼吸道傳播使人患上肺結(jié)核,約占結(jié)核病的85%,所以終末期腎病患者合并肺結(jié)核逐漸受到重視,及時診斷并控制結(jié)核感染對終末期腎病患者提高生存率至關(guān)重要。

結(jié)核病的發(fā)病歷程相對比較隱匿,而終末期腎病患者之所以感染這一類疾病,是因為在早期發(fā)病中很難觀察到明確的臨床癥狀、體征變化及影像學特征,且因為純蛋白衍生物 (purified protein derivative,PPD)試驗受機體免疫能力的影響,所以容易引起假陰性結(jié)果［4］,其準確性備受質(zhì)疑。近幾年,在免疫學檢測技術(shù)的高速化發(fā)展下,γ干擾素釋放試驗(interferon-γrelease assay,IGRA)被廣泛應用于早期結(jié)核病臨床診斷中,其敏感度比較高,特異性也比較強,得到了國際上結(jié)核病防控領(lǐng)域的普遍認可［5-6］。本研究通過對肺結(jié)核患者、終末期腎病患者及終末期腎病合并肺結(jié)核患者進行試驗研究,檢測其血漿中γ干擾素 (interferon-γ,IFN-γ)的含量,并將PPD 試驗與IGRA 試驗分別應用于終末期腎病合并肺結(jié)核患者中,對比2種試驗的陽性率,探討IGRA 在終末期腎病合并肺結(jié)核患者診斷中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 自2015年1月至2016年3月在河北省胸科醫(yī)院招募研究對象,獲得所有受試者的知情同意。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

終末期腎病組40例,為有慢性腎臟病史且腎小球濾過率＜15 ml·min-1·1.73 m-2的患者,無結(jié)核病接觸史及結(jié)核中毒癥狀臨床表現(xiàn),PPD 試驗陰性。其中男22例,女18例,年齡范圍為30～74歲,平均年齡52歲。

肺結(jié)核組40例,為肺結(jié)核初治患者,其抗結(jié)核的臨床治療周期低于4周。其中男19例,女21例,年齡范圍為19～81歲,平均年齡50歲。在這些患者中包含痰抗酸桿菌涂片陽性患者或者痰抗酸桿菌培養(yǎng)陽性患者及痰抗酸桿菌涂片陰性或者培養(yǎng)陰性患者,但在臨床上具有比較明顯的肺結(jié)核特征、臨床表現(xiàn)及影像學特征,且抗結(jié)核治療有效,排除其他痰菌陰性的非結(jié)核性肺部疾病患者。入選者均無基礎(chǔ)腎病, 腎小球濾過率約為125 ml·min-1·1.73 m-2,經(jīng)過臨床證實不存在明顯急性病毒感染史。

終末期腎病合并肺結(jié)核組30例,有慢性腎臟病 史, 且 患 者 的 腎 小 球 濾 過 率 ＜15 ml·min-1·1.73 m-2,通過痰抗酸桿菌涂片、培養(yǎng)陽性等臨床檢驗,或者經(jīng)纖維支氣管鏡、組織病理學檢查及肺活檢,可以確定為抗酸桿菌陽性,或者診斷為菌陰肺結(jié)核,但抗結(jié)核治療有效的新發(fā)肺部疾病患者。其中男21例,女9例,年齡范圍為37～80歲,平均年齡57歲。

1.2 方法

1.2.1 IGRA 試驗 采用英國牛津原裝進口試劑,采用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)進行IGRA 檢測。對血樣進行收集,通過離心操作獲得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),并充分洗滌后對細胞進行計數(shù);PBMC、結(jié)核特異抗原一起放置在預包被抗體的相關(guān)反應孔內(nèi)部,孵育過夜,溫度控制在37 ℃,CO2含量為5%。將T淋巴細胞釋放的細胞因子和預包被的抗體融合起來,然后洗板并引進二抗,進行1 h的孵育;經(jīng)過洗板操作然后引進第五顯色液,7 min后停止蒸餾水的反應,1個斑點代表1個效應T 淋巴細胞。按照產(chǎn)品說明書規(guī)定,當陰性對照孔斑點數(shù)為0～5個,且抗原A 或抗原B 孔斑點數(shù)—陰性對照孔斑點數(shù)≥6;陰性對照孔斑點數(shù)為6～10個,且抗原A 或抗原B孔斑點數(shù)≥2×陰性對照孔斑點數(shù)時,結(jié)果為陽性,否則為陰性。

1.2.2 PPD 試驗 在采集IGRA 試驗用血的同時,對終末期腎病合并肺結(jié)核組進行PPD 試驗,通過皮內(nèi)注射結(jié)核菌純蛋白衍生物0.1 ml,48 h觀察一次,72 h判讀結(jié)果,對經(jīng)過注射而引起局部紅腫處進行觀察,測量其硬結(jié)橫徑及縱徑,取平均值作為硬結(jié)直徑,＜5 mm 為陰性,5～9 mm 為弱陽性,10～19 mm 為陽性,≥20 mm 或者出現(xiàn)局部水泡、局部壞死及淋巴管炎,均診斷為強陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19軟件進行統(tǒng)計學分析。對3 組IFN-γ含量采用Shapiro-Wilk 法進行正態(tài)性檢驗,對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以M(Q1,Q3)表示,3 組IFN-γ 含量的比較采用Wilcoxon秩和檢驗。終末期腎病合并肺結(jié)核組中IGRA與PPD 試驗陽性率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組IFN-γ 含 量 的 比 較 結(jié) 果 顯 示,3 組IFN-γ 含量比較,差異有統(tǒng)計學意義 (Z=0.000,P＜0.01)。終末期腎病合并肺結(jié)核組和肺結(jié)核組患者血清中IFN-γ水平均大于終末期腎病組(P值均＜0.01)。見表1。

表1 3組患者γ干擾素含量的比較［M(Q 1,Q 3),SFCs/2.5×105 PBMC］

2.2 IGRA 試驗與PPD 試驗陽性率的比較 比較2種檢測方法在終末期腎病合并肺結(jié)核組中的診斷性能,IGRA 的診斷陽性率為63.3% (19/30),明顯高于PPD 的診斷陽性率 ［26.7% (8/30),χ2=0.004,P＜0.01］。

3 討論

機體主要通過細胞免疫來對抗結(jié)核菌,然而,在終末期腎病患者中,機體內(nèi)部缺乏充足的營養(yǎng)元素及維生素D,且患者的血磷較高,甲狀旁腺功能亢進,T 細胞CD4+減少、CD8+減少等［7-10］都會引起免疫功能的低下,故容易合并各種感染及疾病,其中結(jié)核感染發(fā)生率較高,是結(jié)核病的高危人群。然而終末期腎病患者合并肺結(jié)核臨床癥狀往往缺乏特異性,結(jié)核常見癥狀如疲勞、厭食、體質(zhì)量減輕和發(fā)熱等常被認為是尿毒癥或透析的致熱源反應或其他細菌感染,且影像表現(xiàn)多不典型,因此易延誤診治［11-12］。不僅如此,終末期腎病患者因免疫力低導致結(jié)核擴散發(fā)展迅速,病死率明顯升高,據(jù)報道,終末期腎病合并結(jié)核的病死率在17%～75%不等［13］。因此,對終末期腎病患者的結(jié)核菌感染進行早期篩查,進而及時治療和有效監(jiān)測,對提高生存率、生活質(zhì)量和結(jié)核病的防治具有重要意義。

目前對于我國結(jié)核病的臨床診斷方法,比較常見的仍為PPD 試驗,但因為PPD 抗原成分錯綜復雜,容易受到卡介苗接種的影響,且非結(jié)核分枝桿菌對其影響也比較大,所以特異度比較低。且在免疫功能低下的患者群體中,其敏感度低下,使得PPD 試驗出現(xiàn)較高的假陰性率［14］。因此,限制了該方法在終末期腎病合并肺結(jié)核患者臨床診斷中的應用。而IGRA 的主要原理為利用結(jié)核分枝桿菌的復合群、少數(shù)具備致病性的分枝桿菌基因內(nèi)部的RD1區(qū)編碼的早期分泌抗原靶6 000蛋白和培養(yǎng)濾液蛋白作為抗原,從而可以對受試者的PBMC 產(chǎn)生刺激作用,然后通過酶聯(lián)免疫斑點法對分泌IFN-γ的細胞進行計數(shù)。且抗原靶6 000蛋白、培養(yǎng)濾液蛋白為結(jié)核菌所特有,在卡介苗與大多數(shù)分枝桿菌中都比較缺乏,所以有效減少了交叉免疫反應的出現(xiàn),提高了檢測特異性［15-16］?，F(xiàn)階段,對于IGRA 的應用,很多指南及建議中都有所體現(xiàn),且被廣泛應用于結(jié)核感染的臨床診斷中。在本次課題研究中,選擇終末期腎病患者、肺結(jié)核患者及終末期腎病合并肺結(jié)核患者為研究對象,對這些患者血漿中IFN-γ的含量進行對比分析,與此同時,在終末期腎病合并肺結(jié)核患者中進行PPD 及IGRA試驗,比較2種試驗的陽性率。根據(jù)研究結(jié)果,終末期腎病患者IFN-γ含量顯著性低于肺結(jié)核患者及終末期腎病合并肺結(jié)核患者。而肺結(jié)核組、終末期腎病合并肺結(jié)核組IFN-γ含量差異無統(tǒng)計學意義。這充分說明,將IGRA 應用于終末期腎病合并肺結(jié)核患者中,對于疾病診斷具有重要的輔助價值。在終末期腎病合并肺結(jié)核患者中,IGRA 試驗陽性率高于PPD 陽性率,這說明對于免疫功能低下的患者,出現(xiàn)PPD 假陰性率的情況比較多,而IGRA 可能是因為機體受到結(jié)核感染時,結(jié)核菌所特有的抗原靶6 000蛋白、培養(yǎng)濾液蛋白抗原刺激機體產(chǎn)生和釋放的IFN-γ量可能主要受結(jié)核特異性抗原所影響,而與免疫反應的強度大小沒有關(guān)系。由此可見,將IGRA 應用于終末期腎病合并肺結(jié)核患者中,免疫狀態(tài)對其影響不大,具備比較強的檢測敏感度,其檢測敏感度明顯超過PPD 試驗。該方法對于終末期腎病合并肺結(jié)核患者,具備較高的臨床輔助價值,這與相關(guān)文獻報道內(nèi)容［17-18］相符。

綜上所述,本研究認為IGRA 在終末期腎病合并肺結(jié)核的診斷中具有較高的敏感度,有利于臨床輔助診斷。但本研究病例資源有限,樣本量過少,數(shù)據(jù)對比較單一,仍需大量樣本研究,以期獲得更準確、客觀的結(jié)果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突