老鹽水中乳酸菌的篩選鑒定及其在青菜頭泡菜中的應(yīng)用

劉玉凌，任亭，彭玉梅，曾勝，賀云川，楊波，欒興霞，李君紅，羅遠莉*

1(重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學院，重慶， 408000)2(重慶市涪陵榨菜集團股份有限公司，重慶, 408000)

泡菜是以各種新鮮蔬菜為原料，利用其表面乳酸菌主導發(fā)酵而成，其營養(yǎng)豐富、風味優(yōu)雅、富含功能菌群，可增食欲、助消化、促健康，是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜制品[1]。涪陵青菜頭、紅心蘿卜，都是重慶市涪陵區(qū)地方特色蔬菜，用青菜頭和紅心蘿卜制作的泡菜具有色澤艷麗、開胃解油膩、爽口增食欲等特點，是本地人們最喜愛的佐餐小菜，但絕大多數(shù)都是本地農(nóng)戶依靠自然發(fā)酵自制而成，其發(fā)酵時間長、受外界因素影響大、產(chǎn)品質(zhì)量波動大，很難大規(guī)模生產(chǎn)。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，泡菜發(fā)酵微生物群落組成、分布及其動態(tài)變化的神秘面紗也逐漸被揭開。近年來研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)四川泡菜鹽水中主要優(yōu)勢菌群有乳桿菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬等，隨著泡菜鹽水的持續(xù)循環(huán)使用，優(yōu)勢菌群越來越單一，但乳桿菌屬始終是優(yōu)勢菌群[2-3]。通過分離篩選優(yōu)良菌株制作發(fā)酵劑，利用人工接種發(fā)酵已成為傳統(tǒng)泡菜工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展趨勢，張夢梅等[4]采用人工接種植物乳桿菌和腸膜明串珠菌發(fā)酵白菜發(fā)現(xiàn)人工接種可以增加泡菜必需氨基酸含量，賦予泡菜更鮮美的滋味，提高感官品質(zhì)。XIA等[5]研究發(fā)現(xiàn)短乳桿菌可降低泡菜pH值和亞硝峰，提高食用安全性。JANG等[6]研究發(fā)現(xiàn)人工接種乳酸鏈球菌可以降低乳酸含量，延長最佳發(fā)酵期。腸膜明串珠菌是發(fā)酵初期到中期的主要菌株，接種腸膜明串珠菌能在泡菜發(fā)酵初期快速啟動發(fā)酵，代謝產(chǎn)物多于未接種發(fā)酵泡菜，具有高產(chǎn)酸、迅速降低pH值和拮抗致病菌的能力[7-9]。樸泓潔等[10]研究表明，接種腸膜明串珠菌可以縮短發(fā)酵周期、增進泡菜滋味、提高泡菜整體品質(zhì)。但人工接種發(fā)酵在涪陵青菜頭泡菜中的應(yīng)用還未見報道，因此，本研究從農(nóng)家自制老鹽水中分離篩選乳酸菌，并將篩選出的優(yōu)勢乳酸菌結(jié)合腸膜明串珠菌制備復合發(fā)酵劑接種到泡菜中，分析接種發(fā)酵對泡菜發(fā)酵過程中理化性質(zhì)、感官的影響，為復合發(fā)酵劑的研制及其工業(yè)化應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

新鮮青菜頭、紅心蘿卜、香辛輔料，重慶市涪陵區(qū)南門山農(nóng)貿(mào)市場。老鹽水，涪陵區(qū)農(nóng)戶家陳年泡菜水。

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (CICC 21861)，分離自泡豬耳朵。

MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責任公司；NaOH、硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠；對氨基苯磺酸鹽酸萘乙二胺(分析純)，天津市光復精細化工研究所；NaNO2(分析純),廣州市全華大化學試劑有限公司；冰乙酸、HCl(分析純)，重慶川東化工(集團)有限公司；CuSO4、亞甲藍、溴甲酚紫、水楊酸、酒石酸鉀鈉(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2 × Taq PCR MasterMix,天根生化科技有限公司；DNA Marker、溶菌酶,寶生物工程(大連)有限公司；通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′),上海立菲生物技術(shù)有限公司(北京)。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZH-150L 立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；PHSJ-3F 酸度計，上海精密科學儀器有限公司；L5S 紫外可見分光光度計，上海儀電分析器有限公司；DHP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學儀器有限公司；LA8080 日立全自動氨基酸自動分析儀，天美(中國)科學儀器有限公司。

1.3 乳酸菌的分離篩選

采用梯度稀釋涂布法對樣品中乳酸菌進行分離篩選，吸取25 mL老鹽水加入到225 mL無菌生理鹽水中，用渦旋振蕩器搖勻，制得10-1的稀釋液，再從中吸取1 mL稀釋液到9 mL無菌生理鹽水中制得10-2的稀釋液，按此法依次制得10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液。分別取100 μL稀釋液于改良MRS培養(yǎng)基(在MRS培養(yǎng)基中添加0.4 g/L的溴甲酚紫)涂布，置于37 ℃下培養(yǎng)48 h。挑取黃色的單菌落[11]進行反復平板劃線純化3次，再挑取單菌落分別進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗，觀察并記錄結(jié)果。將分離純化后的單菌落接種在MRS肉湯中于37 ℃下培養(yǎng)48 h后，與25%甘油按體積比1∶1混合后于-20℃冰箱保存并編號。

1.4 乳酸菌的鑒定

1.4.1 生理生化鑒定

參照潘曉倩等[12]的方法，采用VITEK 2 Compact機器配套CBC鑒定卡進行鑒定。

1.4.2 16S rDNA分子生物學鑒定

采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA，利用通用引物對16S rDNA序列進行擴增，PCR反應(yīng)體系(50 μL)：上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL、2×Taq PCR MasterMix 25 μL、超純水21 μL；PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由中國食品發(fā)酵研究院有限公司進行序列測定。

1.5 接種發(fā)酵泡菜

1.5.1 復合發(fā)酵劑制備

將-20℃冰箱保存的菌株于MRS培養(yǎng)基上活化后，挑取單菌落于MRS肉湯中37 ℃培養(yǎng)48 h，4 500 r/min離心10 min，棄去上清液，加無菌生理鹽水離心洗滌2次，棄去上清液，再加入原培養(yǎng)基體積1/2的無菌生理鹽水制得菌懸液(濃度107～108CFU/mL)，腸膜明串珠菌與乳酸菌ZP11-2菌懸液以體積比1∶1混均得復合乳酸菌發(fā)酵劑，混合后立刻接種。

1.5.2 接種發(fā)酵青菜頭

青菜頭、紅心蘿卜清洗瀝干水分后切塊，按m(青菜頭)：m(紅心蘿卜)：m(涼開水)(鹽質(zhì)量濃度40 g/L)=1∶0.2∶1入壇，再添加冰糖、姜、大蒜、辣椒、花椒，分別按1%接種量添加腸膜明串珠菌、乳酸菌ZP11-2和復合乳酸菌發(fā)酵劑，于25 ℃密封發(fā)酵。對照組為未接種的自然發(fā)酵組，其他工藝和配方與接種發(fā)酵組相同。在發(fā)酵第0、1、2、3、5、7、9天取泡菜水進行各項指標的檢測。

1.6 理化分析

1.6.1 乳酸菌測定

參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中的方法。

1.6.2 pH值和總酸測定

pH值采用pH計測定，總酸參照GB/T 12456—2008 《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法。

1.6.3 亞硝酸鹽測定

參照國標GB/5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法。

1.6.4 游離氨基酸測定

準備取泡菜水樣品1 mL于2 mL塑料離心管中，加入0.5 mL 100 g/L磺基水楊酸溶液振蕩搖勻。冰箱靜置12 h后于13 000 r/min離心2 min，用0.22 μm濾膜過濾，取濾液采用氨基酸自動分析儀進行測定。

氨基酸分析儀色譜分析條件：日立專用離子交換樹脂，4.6 mm ID×60 mm；檢測器：紫外；流速：0.25 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫度：55 ℃；反應(yīng)溫度：135 ℃；柱壓：50 kg/cm2。

1.6.5 感官評價

參照文獻[1, 13]的方法略有改動，總分100分，色澤、香氣、滋味、質(zhì)地4個項目各占25分，選擇10位專業(yè)人員組成感官評定小組，通過盲評計分，對泡菜色澤、香氣、滋味、質(zhì)地進行打分，具體評分標準見表1。

表1 感官評分標準

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)平均測定3次，結(jié)果以(平均值±標準差)表示，并采用SPSS 17.0進行方差分析，Origin 8.1進行相關(guān)圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZP11-2的鑒定

2.1.1 形態(tài)學與生理生化鑒定

菌株ZP11-2,分離自川渝地區(qū)農(nóng)戶家自制老鹽水，在MRS培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h后長勢良好，菌落呈白色，圓形，表面濕潤，不透明，邊緣不整齊；接觸酶陰性，革蘭氏染色陽性，菌體呈桿狀，(0.3～0.5) μm×(1.1～2.1) μm，單個或成對排列，并進一步做了生理生化鑒定，結(jié)果如表2所示。

表2 菌株ZP11-2的生理生化結(jié)果

注：“+”表示陽性；“+w”表示弱陽性；“-”表示陰性。

2.1.2 16S rDNA分子生物學鑒定

經(jīng)PCR擴增和序列測定，獲得菌株ZP11-2的16S rDNA序列片段，與GenBank中LactobacillusbrevisATCC 14869T登錄號為 KI271266的序列同源性達到99.93%，并采用MEGA5.0軟件，鄰位連接法顯示與相關(guān)種的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1所示)，進行1 000次的相似度重復計算，因此確定菌株ZP11-2為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)。

2.2 乳酸菌、pH值和總酸變化

乳酸菌是泡菜發(fā)酵的主要優(yōu)勢菌群，其菌落數(shù)的動態(tài)變化能直觀反映整個發(fā)酵過程[14]。由圖2-A可知，乳酸菌在發(fā)酵第0～5天增長較快，5～9 d相對比較平穩(wěn)，人工接種發(fā)酵泡菜中乳酸菌含量始終高于自然發(fā)酵。發(fā)酵初期0～2 d，人工接種復合發(fā)酵劑和單一菌株發(fā)酵泡菜中乳酸菌增長速率差異不大，但人工接種復合發(fā)酵劑乳酸菌數(shù)量在第2天數(shù)量達到最高9.45 lg CFU/mL，而自然發(fā)酵后期還在緩慢增長。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，其數(shù)量的變化直接影響pH值和總酸的變化。一般以為，泡菜液pH值達到3.5～3.8時，即為發(fā)酵成熟，此時風味在理論上達到最佳[15]。由圖2-B、圖2-C可看出，青菜頭泡菜在整個發(fā)酵過程中，隨發(fā)酵時間的延長pH值呈下降趨勢，總酸呈上升趨勢，7 d后均趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵初期，人工接種復合發(fā)酵劑發(fā)酵pH值、總酸變化幅度較大，第5天時分別為3.47、2.08 g/kg，基本達到穩(wěn)定，但人工接種單一菌株和復合發(fā)酵劑之間差異不大；自然發(fā)酵pH值、總酸變化幅度相對緩慢，在第7天(3.48、2.34 g/kg)才趨于穩(wěn)定，這與乳酸菌菌落數(shù)的變化規(guī)律相符。因為在人工接種發(fā)酵泡菜水中乳酸菌初始含量較多，生長成優(yōu)勢菌群較快，產(chǎn)酸也較多；自然發(fā)酵泡菜水中乳酸菌開始比較少，繁殖所需周期較長，形成優(yōu)勢菌群所需時間也越長[16]，所以產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量都要低于人工接種發(fā)酵，這也說明人工接種發(fā)酵能加快青菜頭泡菜成熟速度，縮短其發(fā)酵周期。

a-乳酸菌菌落數(shù)；b-pH值；c-總酸含量

2.3 亞硝酸鹽變化

如圖3所示，人工接種發(fā)酵與自然發(fā)酵青菜頭泡菜中亞硝酸鹽含量均呈先增加后降低的趨勢，亞硝峰均出現(xiàn)在發(fā)酵第2天，其中人工接種復合發(fā)酵劑亞硝峰最低，含量僅為1.53 mg/kg，明顯低于接種單一菌株腸膜明串珠菌(3.75 mg/kg)、短乳桿菌(2.60 mg/kg)和自然發(fā)酵亞硝峰(7.52 mg/kg)。因為在發(fā)酵初期，在硝酸還原酶的作用下，青菜頭本身帶有的硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽形成亞硝峰[17]，而人工接種發(fā)酵初始乳酸菌含量較多并迅速生長，乳酸菌中含有亞硝酸還原酶能分解亞硝酸鹽，降低亞硝酸鹽的含量；自然發(fā)酵雜菌多，乳酸菌相對較少，含硝酸鹽還原酶的菌將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，形成亞硝峰[18-19]。這說明人工接種乳酸菌發(fā)酵可以降低青菜頭泡菜的亞硝峰，提高其食用安全性，且采用復合發(fā)酵劑接種發(fā)酵更有利于青菜頭泡菜的使用安全。

圖3 青菜頭泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽變化

2.4 游離氨基酸分析

表3中顯示發(fā)酵成熟時泡菜中游離氨基酸含量。依據(jù)氨基酸的呈味特性可將氨基酸分為鮮味氨基酸(天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸)、甜味氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、脯氨酸)、苦味氨基酸(精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸)和芳香族氨基酸(半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)[20]。由表3可知，人工接種發(fā)酵泡菜中共檢測出游離氨基酸16種，比自然發(fā)酵泡菜多檢測出1種人體必需氨基酸(組氨酸)，組氨酸為小兒生長發(fā)育期間必須氨基酸。人工接種發(fā)酵泡菜中游離氨基酸總量、必需氨基酸含量均高于自然發(fā)酵；人工接種復合發(fā)酵劑泡菜中游離氨基酸總量、必需氨基酸含量分別高達68.8、17.36 mg/100mL，均顯著高于人工接種單一菌株和自然發(fā)酵(P<0.05)。游離氨基酸可被人體直接吸收，是人體VE、葉酸的營養(yǎng)來源，其含量和多樣的味感能反應(yīng)食品的營養(yǎng)價值和味覺感受[21]。這說明人工接種復合發(fā)酵劑發(fā)酵能賦予青菜頭泡菜更好的營養(yǎng)價值和較好的口感，這與感官評價結(jié)果一致。

所有呈味氨基酸中，鮮味氨基酸﹥苦味氨基酸﹥甜味氨基酸﹥芳香族氨基酸，其中貢獻較大的是谷氨酸和丙氨酸，在人工接種復合發(fā)酵劑泡菜中的含量分別為18.61和11.29 mg/100mL，共占游離氨基酸總量的43.46%，且都顯著高于人工接種單一菌株和自然發(fā)酵(P<0.05)，這兩種呈味物質(zhì)的閾值也相對較低[22]，易被品嘗出；雖然人工接種復合發(fā)酵劑發(fā)酵泡菜中苦味氨基酸含量也顯著高于單一菌株和自然發(fā)酵(P<0.05)，但并非所有的苦味都是不好的，相關(guān)研究表明,有些苦味肽具有促進生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗高血壓、預防慢性疾病等生理功能[23]，且大部分苦味氨基酸的閾值較高，不易被品嘗出。

表3 青菜頭泡菜中游離氨基酸組成 單位：mg/100 mL

注：同行肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。表4同。“﹣”表示未檢測出；“*”表示必需氨基酸。

2.5 感官分析

由表4可知，人工接種發(fā)酵對青菜頭泡菜感官品質(zhì)具有一定的影響，且人工接種復合發(fā)酵劑發(fā)酵的成熟青菜頭泡菜感官評價總分高于接種單一菌株和自然發(fā)酵，兩種單一菌株間差異不顯著(P<0.05)，但都高于自然發(fā)酵。人工接種復合發(fā)酵劑能顯著提高青菜頭泡菜的色澤和質(zhì)地(P<0.05)，賦予其較濃郁的滋味，接種復合發(fā)酵劑的青菜頭泡菜色澤均勻艷麗、酸甜適中、清脆爽口，具有青菜頭泡菜特有的香氣，更受大家喜歡。

表4 感官評價結(jié)果

3 結(jié)論

從本地農(nóng)戶家自制的老鹽水中分離篩選出1株優(yōu)勢乳酸菌，通過形態(tài)學、生理生化和分子鑒定確定該菌株為短乳桿菌。結(jié)合腸膜明串珠菌制備復合發(fā)酵劑接種發(fā)酵青菜頭泡菜，以自然發(fā)酵作為實驗對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人工接種發(fā)酵在發(fā)酵初期能快速啟動發(fā)酵，增加乳酸菌和總酸含量、降低pH值，人工接種單一菌株和復合發(fā)酵劑之間差異不大，但人工接種復合發(fā)酵劑降亞硝峰能力優(yōu)于單一菌株，使亞硝酸鹽含量控制在1.53 mg/kg以內(nèi)；人工接種復合發(fā)酵劑能顯著增加青菜頭泡菜中游離氨基酸總量、必需氨基酸和呈味氨基酸含量(P<0.05)，且其含量顯著高于單一菌株和自然發(fā)酵(P<0.05)，賦予青菜頭泡菜較濃郁的滋味；感官評價結(jié)果顯示，人工接種發(fā)酵在色澤、質(zhì)地方面顯著優(yōu)于自然發(fā)酵(P<0.05)，酸甜適中，滋味濃郁，清脆爽口，具有青菜頭泡菜特有的香氣，整體更受歡迎。

綜上所述，人工接種復合發(fā)酵劑能夠快速啟動青菜頭泡菜發(fā)酵，縮短發(fā)酵周期，增加游離氨基酸含量，降低亞硝峰，提高食用安全性，為以后復合發(fā)酵劑的研制在泡菜上的應(yīng)用提供一定的實驗基礎(chǔ)。由于泡菜微生物發(fā)酵是一個復雜體系，其作用機理和各微生物之間的相互作用還有待進一步研究。