Lnc-CRCMSL在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

趙 倩， 楊振威， 劉亞萍， 盧桂芳， 和水祥， 李雅睿， 張志勇， 任牡丹

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西省西安市710000；2.西安市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西省西安市710000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤，飲食習(xí)慣、炎癥、基因突變等因素均可導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生。盡管CRC的治療和分子機(jī)制的研究有了重要進(jìn)展，但其治愈率仍然相對(duì)較低[1-2]。目前，化療已廣泛應(yīng)用于癌癥治療，如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是CRC治療的首選抗癌藥物，但腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是限制化療療效的主要問題，而耐藥性產(chǎn)生的原因尚未完全明確[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種具有重要生物學(xué)功能的RNA，可通過多種方式發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的調(diào)控作用，并在癌癥的發(fā)生發(fā)展及抑制腫瘤中發(fā)揮著重要作用[4]。本文探討Lnc-CRCMSL在結(jié)直腸癌中的功能作用，并為順鉑耐藥CRC的治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集2018年2月—2019年9月本院經(jīng)病理證實(shí)的結(jié)直腸癌90例，以及來自同一患者的鄰近正常結(jié)腸組織30例為對(duì)照組。結(jié)直腸癌組織樣本按TNM分期包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各30例。人結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、HCT8、HT29、SW480)和人類胎兒結(jié)腸(human fetal colon,FHC)細(xì)胞系均購(gòu)自美國(guó)American type culture collection(ATCC)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將CRC細(xì)胞系HCT116、HCT8、HT29、SW480和正常FHC細(xì)胞系以及順鉑耐藥SW480/DDP細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，輔以10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液每隔3～5天調(diào)換1次。親代SW480細(xì)胞持續(xù)暴露于含有順鉑培養(yǎng)基中12個(gè)月，順鉑質(zhì)量濃度從0.5 mg/L增加直到細(xì)胞獲得10 mg/L的耐藥性。實(shí)驗(yàn)前，SW480/DDP細(xì)胞需在DMEM培養(yǎng)基(無藥物)中持續(xù)傳代培養(yǎng)2周，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整順鉑質(zhì)量濃度，獲得狀態(tài)良好、穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系?？寺nc-CRCMSL慢病毒載體(Lnc-CRCMSL過表達(dá)組)和相應(yīng)的陰性對(duì)照(陰性對(duì)照組)，轉(zhuǎn)染前，在細(xì)胞達(dá)到30%融合度的1天后將其接種在6孔板上。細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用Invitrogen Lipofectamine?2000(美國(guó)Thermo Fisher Scientific,Inc.)，按照操作說明書進(jìn)行。

1.3 qRT-PCR測(cè)定Lnc-CRCMSL表達(dá)水平

采用TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離總RNA，使用DNaseI(Promega，美國(guó))處理。使用MultiscribeRTkit(Applied Biosystems,USA)和oligo(dT)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增體系：PCR反應(yīng)包含2 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、7.2 μL H2O2和10 μL SYBR；擴(kuò)增條件為95 ℃30 s,95 ℃5 s,60 ℃30 s,循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)水平，GAPDH作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。Lnc-CRCMSL正向引物：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′,反向引物:5′-GGATCCTCCACTAGTGATTTCACT-3′；GAPDH正向引物：5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAG CA-3′,反向引物:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞的凋亡率

采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京比奧生物科技有限公司，中國(guó))進(jìn)行凋亡分析，鑒定并量化凋亡細(xì)胞。細(xì)胞被接種到6孔板上，然后用冷卻的PBS洗滌2次，在緩沖液中復(fù)蘇。貼壁細(xì)胞和漂浮細(xì)胞按照說明書進(jìn)行處理，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,USA)檢測(cè)，以區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

1.5 CCK-8測(cè)定細(xì)胞的增殖活力

使用胰酶消化生長(zhǎng)旺盛的待測(cè)細(xì)胞，制備成5×107個(gè)/L的細(xì)胞懸液，置于96孔培養(yǎng)板，每孔內(nèi)含有100 μL細(xì)胞懸液。放入5%CO2培養(yǎng)箱，孵育72 h，然后每孔添加20 μL 5 g/L MTT溶液，孵育2 h，再緩慢取出培養(yǎng)液，添加DMSO 200 μL，震蕩15 min，檢測(cè)各孔光密度。重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 劃痕愈合試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的遷移能力

在6孔板中均勻接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW480/DDP細(xì)胞，每孔5×105個(gè)細(xì)胞數(shù)。用20 μL移液器槍頭建立細(xì)胞劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗6孔板，去除刮起的漂浮細(xì)胞，每孔加入2 mL無血清DMEM。培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.7 Trasnwell測(cè)定細(xì)胞侵襲能力

采用涂有基質(zhì)膠基質(zhì)的Transwell室(Corning，Inc.，Corning，New York，US)，收集細(xì)胞并將其重懸于培養(yǎng)基中(1×105個(gè)細(xì)胞/mL)。隨后，將細(xì)胞懸浮液(200 μL)加入上室，并將補(bǔ)充有20%FBS(500 μL)的培養(yǎng)基加入下室。在37 ℃溫育24 h后，將浸入基質(zhì)膠的細(xì)胞固定，染色并計(jì)數(shù)。

1.8 免疫蛋白印跡測(cè)定MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)

采用RIPA裂解緩沖液(Beyotime Biotechnology，中國(guó))和蛋白酶抑制劑(Roche，中國(guó))提取所用蛋白。使用BCATM蛋白分析試劑盒(Pierce，美國(guó))對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。取相同量總蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在37 ℃下用5%脫脂乳封閉1 h，在4 ℃下用以下抗體孵育過夜?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)和GAPDH的相關(guān)抗體購(gòu)自武漢三陽生物技術(shù)有限公司。PVDF膜用TBS洗滌3次，室溫孵育2 h，采用Fusion FX5圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Lnc-CRCMSL在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

Lnc-CRCMSL在CRC組織中表達(dá)量低于正常癌旁組織，且在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)量低于Ⅰ期(P<0.05；圖1A、B)。Lnc-CRCMSL在結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、HCT8、HT29、SW480)中的表達(dá)量低于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系(P<0.05；圖1C)。

圖1 Lnc-CRCMSL在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2 結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞SW480/DDP的建立與鑒定

在SW480和耐藥細(xì)胞系SW480/DDP中檢測(cè)Lnc-CRCMSL表達(dá)，qRT-PCR分析表明，SW480/DDP細(xì)胞系中Lnc-CRCMSL表達(dá)水平明顯降低(P<0.05；圖2)，SW480/DDP的細(xì)胞存活率較SW480顯著增加(P<0.05；圖2)。

圖2 Lnc-CRCMSL在結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)及其細(xì)胞生存率情況

2.3 Lnc-CRCMSL過表達(dá)對(duì)SW480/DDP凋亡率與增殖活力的影響

Lnc-CRCMSL過表達(dá)顯著提高SW480/DDP的凋亡率，同時(shí)也明顯降低細(xì)胞增殖活力(P<0.05；圖3)。

圖3 Lnc-CRCMSL過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率與增殖活力的影響

2.4 Lnc-CRCMSL過表達(dá)對(duì)SW480/DDP遷移與侵襲能力的影響

Lnc-CRCMSL過表達(dá)顯著抑制了SW480/DDP的遷移和侵襲能力(P<0.05；圖4)。

圖4 Lnc-CRCMSL過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

2.5 Lnc-CRCMSL過表達(dá)對(duì)SW480/DDP的MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的影響

Lnc-CRCMSL過表達(dá)顯著降低了SW480/DDP的MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平(P<0.05；圖5)。

圖5 Lnc-CRCMSL過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞

3 討 論

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率?；熓侵委熃Y(jié)直腸癌晚期患者最主要的方式，其中順鉑在結(jié)直腸癌患者的治療中應(yīng)用較為廣泛[5]。據(jù)報(bào)道，順鉑耐藥性是治療多種癌癥的重要問題[6]。Zhuang等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-143能夠調(diào)控人胃癌細(xì)胞株順鉑的耐藥性。Tian等[8]證實(shí)miR-490-3p通過下調(diào)ABCC2的表達(dá)增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。lncRNAs參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的全部過程，并且在各種癌癥中存在異常表達(dá)，并與腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)[9-10]。Yang等[11]研究指出，lncRNA AK126698可通過Wnt途徑調(diào)控肺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。lncRNA TUG1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中通過介導(dǎo)miR186/CPEB2表達(dá)，影響癌細(xì)胞對(duì)甲氨蝶呤耐藥性[12]。lncRNA MALAT1通過調(diào)控EZH2表達(dá)水平參與結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性[13]。

本研究結(jié)果顯示，Lnc-CRCMSL在結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織中表達(dá)水平均顯著下降，并隨著病情的加重下降更加明顯。此外，通過構(gòu)建順鉑耐藥SW480/DDP細(xì)胞系，檢測(cè)Lnc-CRCMSL在SW480和SW480/DDP中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)SW480/DDP細(xì)胞系中Lnc-CRCMSL表達(dá)水平明顯降低，而SW480/DDP細(xì)胞的存活率較SW480顯著增加。Lnc-CRCMSL在SW480/DDP細(xì)胞中過表達(dá)后SW480/DDP細(xì)胞的存活率顯著降低?？梢?，Lnc-CRCMSL在耐藥細(xì)胞中過表達(dá)可以有效降低順鉑耐藥性。

研究表明，化療藥物主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤的作用[14-16]。化療藥物耐藥性的產(chǎn)生與細(xì)胞凋亡抑制密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Lnc-CRCMSL過表達(dá)顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞增殖活力，顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲。同時(shí)，在Lnc-CRCMSL過表達(dá)的SW480/DDP中，MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平則顯著降低?；|(zhì)金屬蛋白酶是鋅和鈣依賴性蛋白酶，起著降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，而細(xì)胞外基質(zhì)可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP2和MMP9與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，并在癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲中表現(xiàn)出高水平的表達(dá)[17-19]?？梢?，Lnc-CRCMSL可調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究揭示了Lnc-CRCMSL在結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥中的作用，可能為結(jié)直腸癌的治療提供新的思路和方向。