牛磺酸對(duì)抑郁癥模型小鼠的預(yù)防性干預(yù)作用

袁 靜，閆晨靜，周 茜，牛佳卉，吳夢(mèng)穎，王亞旭，王 頡，趙 文*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北 保定 071001）

抑郁癥主要表現(xiàn)為心境持久低落，思維遲鈍，食欲缺乏和體質(zhì)量減輕，意志行為減少，嚴(yán)重者出現(xiàn)自殺企圖或行為[1-2]，是一種在世界上廣泛流行的精神疾患[3]，全球各年齡層共有約3億 人患有抑郁癥。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的預(yù)測(cè)，抑郁癥的發(fā)病率每年增加113%，預(yù)計(jì)到2020年成為世界第二大疾病負(fù)擔(dān)[4]。但目前廣泛使用的抗抑郁藥物具有很大局限性，且長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用，開(kāi)發(fā)安全有效的預(yù)防抑郁癥藥物或通過(guò)營(yíng)養(yǎng)干預(yù)緩解抑郁癥是當(dāng)今社會(huì)亟待解決的問(wèn)題。研究表明，從食物中提取的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，比如乳源活性肽[5]、桔梗[6]、茯苓多糖[7]、小分子化合物（CXZ-123）[8]等都對(duì)抑郁癥有緩解作用。

?；撬嶙鳛轶w內(nèi)含量最豐富的含硫氨基酸，以游離狀態(tài)存在[9]，是人體正常生理活動(dòng)所必需的活性物質(zhì)，?；撬岵粌H參與維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而且在神經(jīng)、心血管、免疫和內(nèi)分泌等系統(tǒng)生理功能的正常發(fā)揮起著重要的調(diào)節(jié)作用[10]。牛磺酸作為一種機(jī)體的內(nèi)源性抗損傷物質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)具有多種生理功能，但對(duì)其抑郁癥的干預(yù)作用鮮有研究，Wu Gaofeng等[11]對(duì)?；撬岬目挂钟糇饔眠M(jìn)行研究，通過(guò)慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激（CUMS）抑郁模型證明了?；撬峋哂锌挂钟糇饔?。在目前的抗抑郁研究中，抑郁癥的動(dòng)物模型建立方法主要包括應(yīng)激模型和藥物誘導(dǎo)模型兩大類(lèi)，本實(shí)驗(yàn)利用兩種常用的抑郁模型——小鼠行為絕望模型和利血平誘導(dǎo)急性抑郁模型來(lái)探討?；撬岬目挂钟糇饔茫瑸榕；撬峥挂钟糇饔脵C(jī)制的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

ICR小鼠，SPF級(jí)，雄性，18～22 g，購(gòu)于北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0004。動(dòng)物自然節(jié)律光照，適應(yīng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

?；撬幔兌取?9.9%） 上海康丁生物科技有限公司；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒、多巴胺（dopamine，DA）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒、單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒、促腎上腺皮質(zhì)激素（adreno-cortico-tropichormone，ACTH）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒、皮質(zhì)醇（cortisol，COR）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒 上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-ⅡD型超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；1500-823型全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 北京鑫骉騰達(dá)儀器設(shè)備有限公司；3-18R型低溫（0～4 ℃）高速離心機(jī) 湖南恒諾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 行為絕望小鼠模型

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分成6 組：陰性對(duì)照組（蒸餾水）、氟西汀對(duì)照組（氟西汀10 mg/kgmb）、?；撬岬?、中、高劑量組（天然?；撬?.5、1、2 g/kgmb），每組10 只。連續(xù)灌胃至第8天進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)，第9天進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，第10天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[12]。

1.3.2 利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠模型

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，動(dòng)物分組與劑量設(shè)計(jì)同1.3.1節(jié)。連續(xù)灌胃14 d，最后一次灌胃30 min后陰性對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射利血平（2.5 mg/kgmb），1 h后觀察小鼠眼瞼下垂情況（分級(jí)判斷下垂度），3 h后測(cè)肛溫、出圈率[13]。

記錄小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血，頸椎脫臼處死動(dòng)物，冰臺(tái)取腦組織并稱(chēng)質(zhì)量。分離血清、血漿，制備腦勻漿，測(cè)定血清ATCH、BDNF、血漿COR、腦勻漿5-HT、NE、DA、MAO、CRF水平。

1.3.3 行為學(xué)指標(biāo)

1.3.3.1 眼瞼下垂

判斷眼瞼下程度。0 度：正常睜眼；1 度：眼瞼下垂1/4；2 度：眼瞼下垂1/2；3 度：眼瞼下垂：3/4；4 度：眼瞼完全閉合[14]。

1.3.3.2 肛溫

小鼠肛溫計(jì)探頭涂抹甘油后插入小鼠肛門(mén)1 cm處測(cè)量肛溫。

1.3.3.3 出圈率

將小鼠放入直徑7.5 cm的白紙圓圈內(nèi)觀察15 s，計(jì)算每組小鼠的出圈率。

1.3.3.4 懸尾實(shí)驗(yàn)

末次給藥60 min后，用醫(yī)用膠布將小鼠尾（在距尾尖1 cm處）[15]粘在高出桌面15 cm的橫桿上，使其呈倒立狀態(tài)，四周以板隔離小鼠視線(xiàn)。小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動(dòng)，但活動(dòng)一段時(shí)間后出現(xiàn)間隙性靜止，即顯示失望狀態(tài)。適應(yīng)1 min后，記錄5 min內(nèi)小鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

1.3.3.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

末次給藥60 min后，將小鼠置于水溫20～25 ℃，水深10 cm的游泳水槽中，強(qiáng)迫游泳6 min，觀察并記錄后4 min內(nèi)小鼠靜止時(shí)間。當(dāng)小鼠呈漂浮狀態(tài)停止掙扎時(shí)記錄游泳不動(dòng)時(shí)間（小鼠僅做輕微動(dòng)作以保持頭部浮于水面上也視為游泳不動(dòng)）[16]。

1.3.3.6 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

采用紙質(zhì)敞箱（50 cmh50 cmh50 cm），底面劃分為面積相等的25 個(gè)白色方格（10 cmh10 cm）。給藥60 min后將小鼠置于曠場(chǎng)內(nèi)，觀察5 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)情況，包括水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)（三爪以上跨入鄰格次數(shù)）、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)（兩前肢離地1 cm以上的次數(shù)，包括直立及攀附墻體）[17-18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)對(duì)行為學(xué)觀測(cè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本實(shí)驗(yàn)所有統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)差異的操作均用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。組間比較采用單因素方差分析法：P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛磺酸對(duì)行為絕望小鼠干預(yù)作用

圖 1 ?；撬釋?duì)行為絕望小鼠干預(yù)作用的影響（n＝ 10）Fig. 1 Interventional effect of taurine on behavioral despair in mice (n = 10)

由圖1a可知，與陰性對(duì)照組相比，?；撬? 個(gè)劑量組懸尾不動(dòng)時(shí)間分別降低了17.06%、47.22%、55.72%，其中低劑量組差異顯著（P＜0.05），中、高劑量組差異極顯著（P＜0.01），且效果略?xún)?yōu)于氟西汀（降低44.72%）；圖1b中與陰性對(duì)照組相比，氟西汀組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短17.85%（P＞0.05）。牛磺酸中劑量組顯著降低21.69%（P＜0.05），高劑量組極顯著降低49.17%（P＜0.01）；小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)圖1c中，與陰性對(duì)照組相比，?；撬嶂袆┝拷M水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)顯著升高21.45%（P＜0.05），高劑量組極顯著性升高28.41%（P＜0.01）；與氟西汀對(duì)照組相比，低、中劑量組豎直運(yùn)動(dòng)次數(shù)分別降低26.79%（P＜0.01）、18.96%（P＜0.05），表明?；撬嵩谔岣咝∈笞灾鬟\(yùn)動(dòng)水平上與氟西汀對(duì)照組相似。

2.2 ?；撬釋?duì)利血平誘導(dǎo)抑郁模型小鼠體質(zhì)量、腦質(zhì)量的影響

表 1 ?；撬釋?duì)小鼠體質(zhì)量和腦質(zhì)量的影響（n＝ 10）Table 1 Effect of taurine on body mass and brain mass in mice (n= 10)

由表1可知，陰性對(duì)照組、模型組、氟西汀對(duì)照組小鼠相比，體質(zhì)量、腦質(zhì)量均無(wú)顯著性差異，表明抑郁對(duì)小鼠體質(zhì)量、腦質(zhì)量影響不大。表明?；撬釋?duì)利血平誘導(dǎo)的抑郁模型小鼠體質(zhì)量、腦質(zhì)量無(wú)明顯影響。

2.3 牛磺酸對(duì)利血平誘導(dǎo)抑郁模型小鼠眼瞼下垂度、體溫、出圈率的影響

表 2 牛磺酸對(duì)小鼠眼瞼下垂度、體溫、出圈率的影響（n＝ 10）Table 2 Effect of taurine on ptosis, body temperature and escape rate of mice (n= 10)

由表2可知，與陰性對(duì)照組相比，模型組小鼠眼瞼下垂度、體溫均顯示出極顯著性差異（P＜0.01），表明抑郁模型建模成功。與模型組相比，?；撬峤M眼瞼下垂度無(wú)顯著性差異（P＞0.05），且?；撬釋?duì)抑郁小鼠體溫?zé)o顯著性影響。與模型組相比，氟西汀對(duì)照組眼瞼下垂度、體溫顯示出極顯著性差異（P＜0.01），表明陽(yáng)性藥物可以緩解利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠的抑郁表象特征。

2.4 ?；撬釋?duì)利血平誘導(dǎo)抑郁模型小鼠5-HT、DA、NE的影響

圖 2 ?；撬釋?duì)小鼠腦組織5-HT（a）、DA（b）和NE（c）含量的影響（n＝ 10）Fig. 2 Effect of taurine on 5-HT (a), DA (b) and NE (c) contents in brain tissues of mice (n = 10)

由圖2可知，與陰性對(duì)照組相比，模型組小鼠5-HT、DA、NE均分別極顯著下降（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，?；撬嶂袆┝拷MDA、NE分別顯著上升20.46%、24.85%（P＜0.05），高劑量5-HT顯著上升19.09%（P＜0.05），DA、NE分別極顯著上升27.03%、30.66%（P＜0.01）。表明?；撬峋哂猩咭钟粜∈竽X組織5-HT、DA、NE的作用。與氟西汀對(duì)照組比較，?；撬岣邉┝拷M與陽(yáng)性藥物效果相當(dāng)。

2.5 ?；撬釋?duì)利血平誘導(dǎo)抑郁模型小鼠MAO活力和BDNF含量的影響

圖 3 ?；撬釋?duì)小鼠MAO活力（a）、BDNF含量（b）的影響（n＝ 10）Fig. 3 Effect of taurine on MAO (a) and BDNF (b) contents in mice (n = 10)

如圖3所示，與陰性對(duì)照組相比，模型組小鼠MAO活力極顯著上升39.87%，BDNF含量極顯著下降33.97%（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，牛磺酸低、中、高劑量組MAO活力分別極顯著下降了9.42%、13.82%、16.77%（P＜0.01）。表明?；撬嵊薪档鸵钟粜∈驧AO活力，并升高BDNF含量的作用，且高劑量組與氟西汀組接近。

2.6 ?；撬釋?duì)利血平誘導(dǎo)抑郁模型小鼠CRF、ACTH、COR含量的影響

圖 4 ?；撬釋?duì)小鼠血清CRF含量（a）、ACTH含量（b）和血漿COR含量（c）的影響（n＝ 10）Fig. 4 Effect of taurine on CRF (a), ACTH (b) and COR (c) content in serum of mice (n = 10)

如圖4所示，與陰性對(duì)照組相比，模型組小鼠CRF、ACTH、COR含量均極顯著上升（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，?；撬岬蛣┝拷MACTH、COR含量分別顯著下降17.05%、20.90%（P＜0.05），中劑量組CRF、ACTH、COR含量分別極顯著下降11.07%、25.14%、25.49%，高劑量組CRF、ACTH、COR含量分別極顯著下降19.52%、27.40%、33.14%（P＜0.01）。表明?；撬峥梢越档鸵钟粜∈驝RF、ACTH、COR水平，與氟西汀對(duì)照組比較，高劑量組牛磺酸與其相似。

3 討 論

懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為表現(xiàn)而對(duì)抗抑郁藥物進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察記錄小鼠自主活動(dòng)情況，提高了抗抑郁藥物篩選的可靠性。3 種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合進(jìn)行有利于全面考察抗抑郁藥的作用效果，被廣泛用于抗抑郁藥物的初篩。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛磺酸（1、2 g/kgmb）能夠顯著降低小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，并增加小鼠自主運(yùn)動(dòng)水平，發(fā)現(xiàn)與氟西汀對(duì)照組的效果相當(dāng)，且具有劑量相關(guān)性，說(shuō)明牛磺酸可以有效縮短小鼠行為絕望時(shí)間，初步確定其可能具有一定的干預(yù)抑郁功效。

進(jìn)一步采用對(duì)藥物誘發(fā)的抑郁動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究，根據(jù)已知抗抑郁藥的基本藥理作用，建立藥物誘導(dǎo)作用的動(dòng)物模型。通過(guò)藥物相互作用的抑郁動(dòng)物模型，并對(duì)?；撬岬目挂钟糇饔眯再|(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行探討。利血平是一種吲哚型生物堿，研究發(fā)現(xiàn)，利血平具有鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)的作用，長(zhǎng)期使用利血平可引起單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE的耗竭，同時(shí)伴隨眼瞼下垂、體溫降低、身體僵直等臨床癥狀，與抑郁癥癥狀相同[19-21]。利血平誘導(dǎo)抑郁模型具有造模時(shí)間短、減少動(dòng)物的痛苦和造模過(guò)程簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，是最早發(fā)展的抑郁動(dòng)物模型[22]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于抑郁模型的建立。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究牛磺酸對(duì)利血平誘導(dǎo)小鼠急性抑郁模型影響，發(fā)現(xiàn)牛磺酸對(duì)小鼠眼瞼下垂、體溫下降、運(yùn)動(dòng)不能癥狀具有緩解作用。

抑郁產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前為止，主要概括為以下幾種學(xué)說(shuō)[23-25]：1）單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)：該假說(shuō)認(rèn)為抑郁癥是由于患者腦內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突出間隙DA、NE、5-HT等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)濃度水平或功能下降所致[25-26]；2）受體假說(shuō)：腦中單胺神經(jīng)遞質(zhì)受體敏感性增高引發(fā)抑郁癥，以5-HT受體功能改變?yōu)橹鱗27-29]；3）神經(jīng)內(nèi)分泌假說(shuō)：該假說(shuō)包括下丘腦-垂體-腎上腺素軸（HPA）學(xué)說(shuō)，主要表現(xiàn)為CRF含量升高，ACTH分泌增強(qiáng)，致使COR過(guò)度分泌，負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞，進(jìn)而引起前額皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，導(dǎo)致認(rèn)知能力下降[30]；4）腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）假說(shuō)：該假說(shuō)表明壓力會(huì)減少前額皮層和海馬區(qū)的BDNF的表達(dá)和功能，致使神經(jīng)元萎縮，也會(huì)少抑郁癥患者血液中的BDNF水平[31-32]。單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)是目前最為公認(rèn)的抑郁機(jī)制學(xué)說(shuō)，該假說(shuō)認(rèn)為抑郁癥是由于患者腦內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突出間隙5-HT、DA、NE等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)濃度水平或功能下降所致，研究報(bào)道可知5-HT是色氨酸代謝產(chǎn)物之一，對(duì)情緒與認(rèn)知的調(diào)控起重要作用[33]。因此可通過(guò)測(cè)定單胺遞質(zhì)水平直接判定抑郁程度。HPA亢進(jìn)學(xué)說(shuō)主要表現(xiàn)為CRF、ACTH、COR的過(guò)度分泌，負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞，產(chǎn)生抑郁癥狀。而B(niǎo)DNF水平的下降也與神經(jīng)元萎縮密切相關(guān)，是抑郁癥的重要檢測(cè)指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸可對(duì)抗利血平誘導(dǎo)的急性抑郁模型小鼠5-HT、DA、NE含量下降，降低MAO活性與CRF、ACTH、COR的過(guò)渡分泌，升高BDNF水平的作用，推測(cè)牛磺酸干預(yù)抑郁作用機(jī)制與神經(jīng)單胺遞質(zhì)假說(shuō)、神經(jīng)內(nèi)分泌假說(shuō)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子假說(shuō)密切相關(guān)，?；撬峥挂钟舻淖饔脵C(jī)制還不能完全闡明，對(duì)哪些信號(hào)通路具有干預(yù)作用，這些信號(hào)通路之間又是怎樣相互作用和相互聯(lián)系的需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸可以有效縮短小鼠行為絕望時(shí)間，具有一定的干預(yù)抑郁功效。此外，?；撬嵋欢▌┝織l件下還能夠緩解利血平誘導(dǎo)的小鼠抑郁，并明顯升高小鼠腦組織5-HT、DA、NE水平，降低MAO活性，并升高BDNF含量，同時(shí)抑制CRF、ACTH、COR的過(guò)度分泌，表明?；撬嶙鳛轭A(yù)防抑郁癥的膳食補(bǔ)充劑有良好的開(kāi)發(fā)前景。