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    LC/MS/MS法測定柚皮苷在大鼠血漿中的濃度及其藥代動力學研究

    2020-02-29 20:16郭俐麟唐冰雯
    科學導報·學術(shù) 2020年4期

    郭俐麟 唐冰雯

    摘? 要:目的:建立LC/MS/MS法測定大鼠血漿中柚皮苷濃度,并考查其藥代動力學特征。方法:采用Sepax HP-C18色譜柱:(100 mm×2.1 mm,5 μm),以甲醇-2 mmol·L-1醋酸銨溶液(65:35)為流動相;流速:0.3 ml·min-1。離子源為ESI源,正離子模式進行檢測。結(jié)果:大鼠靜脈注射給藥柚皮苷后,血漿中可以迅速檢測到大量的柚皮苷與少量的代謝產(chǎn)物柚皮素。柚皮苷的Tmax為0.083 h,達峰濃度Cmax為56583.33 ng·ml-1;柚皮素葡萄糖醛酸結(jié)合物的Tmax為12 h,達峰濃度Cmax為653.68 ng·ml-1。結(jié)論:該方法選擇性強、靈敏度好,可用于測定大鼠生物樣本中柚皮苷及其代謝產(chǎn)物柚皮素的濃度。

    關(guān)鍵詞:柚皮苷;柚皮素;LC/MS/MS;藥代動力學

    Abstract Objective:To establish a LC/MS/MS method for the determination and pharmacokinetic study of naringin in rats plasma.Method:A Sepax HP-C18? column was used,with the mobile phase of methanol-2 mmol·L-1 ammonium acetate(65:35).The flow rate:0.3 ml·min-1.The determination used electrospray ionization mass spectrometry with positive ionization mode.Results:After intravenous administration the naringin,in blood,we can rapidly determine many naringin and a little naringenin in vivo.Tmax of? naringin is 0.083 h,Cmax is 56583.33 ng·ml-1;Tmax of naringenin glucuronides is 12 h,Cmax is 653.68 ng·ml-1.Conclution:The method is selective and sensitive and can be used to determine the concentration of naringin and its metabolite(naringenin).

    Key words:naringin;naringenin;LC/MS/MS;pharmacokinetics

    柚皮苷屬于二氫黃酮苷,主要存在于柚、葡萄柚和酸橙及其變種的果皮及果實中,研究表明其具有抗氧化[1][2]、抑菌[3]、抗癌[4][5]等作用,柚皮苷作為一類重要的中藥化學成分,由于它的功效顯著,具有良好的開發(fā)前景,對其的研究也愈來愈熱,對它的吸收和代謝等的藥代動力學研究必將愈加深入,藥代動力學方法學研究是藥代動力學研究的基石,然而柚皮苷在藥代動力學及其方法學方面的研究報道較少[6],多數(shù)采用高效液相色譜法進行研究,其靈敏度不夠高,分析時間長。采用LC/MS/MS法對其進行定性和定量分析,可提高靈敏度,縮短分析時間,提高了工作效率,這對全面進行柚皮苷藥代動力學研究發(fā)揮了厚積薄發(fā)的作用,進而對于了解柚皮苷的作用機制,指導臨床合理用藥、優(yōu)選用藥方案、指導柚皮苷劑型改革和新藥研究設計都具有重要的意義。

    1 儀器、試藥

    1.1 儀器

    美國應用生物系統(tǒng)公司(AB)API 3000 型號LC/MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀,包括電噴霧離子化源(ESI),大氣壓化學離子化源(APCI),島津Shimadzu LC-10 ADVP 雙高壓梯度洗脫裝置、DGM-12 AM 在線脫氣機,并配有直接進樣用針泵及1 ml進樣器以及AB公司ANALYST 1.3 數(shù)據(jù)處理軟件;Shimadzu ΜV-2501 PC 紫外分光光度計、日本島津Shimadzu LC-Vp series 高效液相儀系統(tǒng);上海安亭科學儀器廠TGL-16G 離心機;組織勻漿器;上海滬西分析儀器廠WH-3 渦旋混合儀;分析天平(Mettler Toledo,AG 135)

    1.2 試藥

    對照品柚皮苷(批號:110722-200708,中國生物制品檢定所);對照品柚皮素(批號:09020121,上海同田生物技術(shù)有限公司);橙皮苷(批號:110721-200512,中國生物制品檢定所);

    甲醇(色譜純,美國Fisher公司);醋酸銨(色譜純,美國TEDIA公司);純化水;乙酸乙酯(分析純)

    2 動物與給藥方式

    SD 大鼠(SPF級,動物合格證號為SCXK(粵)2003-0002,粵監(jiān)證字2006A015)20只,雌雄各半,體重300±20 g。SD 大鼠10只,分為2組,實驗前一天禁食12 h,自由飲水,按45mg/kg劑量給藥,靜脈注射給藥柚皮苷原料,于預定的時間點(0 min,5 min,10 min,15 min,30 min,35 min,45 min,1 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h,24 h)大鼠眼眶取血。

    3 檢測條件

    3.1 色譜條件 色譜柱:Sepax HP-C18(100 mm×2.1 mm,5 μm),預柱:菲羅門;流動相:甲醇:2mmol·L-1醋酸銨(65:35);流速:0.3 ml·min-1;柱溫:室溫;進樣體積:20 μl。

    3.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子化源(ESI);掃描方式:正離子多反應離子監(jiān)測;鞘氣,碰撞氣,輔助氣均為氮氣;解離電壓:58 V;聚焦電壓:380 V;入口電壓:26 V;碰撞池入口電壓:8 V;電噴霧電壓:5000 V;輔助氣溫度:360 ℃;霧化氣:8;門簾氣:10;碰撞氣:7;多反應離子監(jiān)測:柚皮苷:581.3/273.3,碰撞能8 V,掃描時間200 ms;柚皮素:273.4/153.1,碰撞能6 V,掃描時間200 ms;橙皮苷(內(nèi)標):611.1/303.3,碰撞能:12 V,掃描時間:200 ms。采用DAS 2.0藥代動力學軟件,用統(tǒng)計距計算藥物代謝動力學參數(shù)。

    4 方法和結(jié)果

    4.1 儲備液的配制

    柚皮苷標準儲備液:稱取105 ℃干燥至恒重的柚皮苷對照品約10 mg,精密稱定,置于50 ml容量瓶中,用甲醇溶解定容,配制成濃度為200 μg·ml-1標準儲備液。

    柚皮素標準儲備液:稱取105 ℃干燥至恒重的柚皮素對照品約10 mg,精密稱定,置于50 ml容量瓶中,用甲醇溶解定容,配制成濃度為200 μg·ml-1的標準儲備液。

    內(nèi)標標準儲備液:稱取橙皮苷對照品10 mg,精密稱定,置于50 ml容量瓶中,用甲醇定容,配制成濃度為200 μg·ml-1的溶液作標準儲備液。

    4.2 生物樣品的制備

    4.2.1 血漿樣品的制備

    大鼠眼眶取血,置1.5 ml肝素處理的塑料離心管中,6000 rpm離心10 min;分取血漿,置冰箱中-20℃保存;供測定用。

    4.3 生物樣品的處理方法

    4.3.1 血漿或組織樣品處理方法

    取動物血樣100 μl,置1.5 ml離心管中,加入5 μg·ml-1內(nèi)標橙皮苷對照品溶液10 μl,渦旋混合儀上渦旋30s,加入700 μl乙酸乙酯進行萃取,渦旋2 min,離心機上9000 r/m離心10 min,取上清液,室溫下?lián)]干溶劑。殘渣用流動相(甲醇:2mmol醋酸銨=65:35)100 μl重溶,進樣20 μl。

    4.3.2 酶解的處理方法

    取血樣100 μl,置1.5 ml離心管中,加入10 μl酶(β-葡萄糖苷酸酶),37 ℃水浴1小時,取出,加入內(nèi)標溶液10 μl,其余操作同4.3.1。

    4.4 方法學考察

    4.4.1 方法專屬性

    按生物樣品預處理方法進行考察,考察6只不同動物個體空白樣本,比較空白血漿、加入內(nèi)標和對照品的血漿以及給藥后的某一時間點血樣的色譜圖,確定方法的專屬性。結(jié)果見圖1,結(jié)果表明:空白血漿不干擾待測物及內(nèi)標的測定。

    4.4.2? 靈敏度考察

    將濃度為100 ng·ml-1柚皮苷標準溶液、柚皮素標準溶液進行稀釋,按4.3.1分別制成血漿樣品進行液質(zhì)檢測,當峰高為噪音的3倍(S/N=3),得到柚皮苷檢測限為0.5 ng·ml-1。柚皮素檢測限為0.5 ng·ml-1。

    4.4.3? 標準曲線與線性范圍

    按4.3.1項下操作,制成血漿中柚皮苷和柚皮素濃度分別為:10 ng·ml-1、50 ng·ml-1、100 ng·ml-1、500 ng·ml-1、1000 ng·ml-1、2500 ng·ml-1的血漿樣品。用液質(zhì)聯(lián)用儀正離子MRM方式進行檢測,每個樣品進樣20μl。以柚皮苷與內(nèi)標的峰面積比和血漿樣品中柚皮苷濃度進行線性回歸,即得標準曲線方程和線性范圍,標準曲線方程為:Y=0.0016X+0.00672(r=0.9992),以柚皮素與內(nèi)標的峰面積比和血漿樣品中柚皮素濃度進行線性回歸,即得標準曲線方程和線性范圍,標準曲線方程為:Y=0.0015X+0.0083(r=0.9948),柚皮苷在10 ng·ml-1~2500 ng·ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,柚皮素在10 ng·ml-1~2500 ng·ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    4.4.4? 精密度、準確度試驗

    按4.3.1項下操作,制備柚皮苷(2000 ng·ml-1,800 ng·ml-1,20 ng·ml-1)和柚皮素(2000 ng·ml-1,800 ng·ml-1,20 ng·ml-1)高、中、低三個濃度生物樣品,用液質(zhì)檢測(n=5),求得測定濃度值與平均值,計算RSD%,為日內(nèi)精密度,每天進樣一次,共三天,計算RSD%,為日間精密度。柚皮苷日內(nèi)精密度RSD為4.76%、8.84%、5.99%,柚皮苷日間精密度RSD為2.88%、0.70%、4.37%;柚皮素日內(nèi)精密度RSD為3.48%、6.80%、2.12%,柚皮素日間精密度RSD為5.23%、3.72%、3.51%。結(jié)果表明,柚皮苷、柚皮素日內(nèi)和日間精密度良好。

    4.4.5提取回收率

    按4.3.1項下操作,制備柚皮苷(2000 ng·ml-1,800 ng·ml-1,20 ng·ml-1)和柚皮素(2000 ng·ml-1,800 ng·ml-1,20 ng·ml-1)高、中、低三個濃度生物樣品,每個濃度5個樣本。量取20 μl,注入LC/MS/MS,記錄質(zhì)譜圖。

    另取1.5 ml塑料離心管,分別加入相應的柚皮苷和柚皮素標準溶液用流動相稀釋,制成相應濃度的標準溶液樣品,記錄質(zhì)譜圖。按公式計算,分別求出柚皮苷和柚皮素提取回收率和RSD值。結(jié)果顯示柚皮苷高、中、低3個濃度提取回收率分別為40.2%、43.1%、41.6%,RSD為3.55%、4.62%、6.14%。柚皮素高、中、低3個濃度提取回收率分別為61.6%、64.2%、74.0%,RSD為3.01%、2.20%、7.96%。

    4.4.6方法回收率試驗

    按4.3.1項下操作,制備柚皮苷(2000 ng·ml-1,800 ng·ml-1,20 ng·ml-1)和柚皮素(2000 ng·ml-1,800 ng·ml-1,20 ng·ml-1)高、中、低三個濃度生物樣品,每個濃度5個樣本。用液質(zhì)進行檢測,測得信號值代入回歸方程,求得測定值。以測得濃度與加入量比較,計算高、中、低3個濃度的方法回收率,結(jié)果見表1、表2:

    4.4.7? 穩(wěn)定性試驗

    按4.3.1項下操作,制備濃度分別為20ng·ml-1、800ng·ml-1、2000ng·ml-1的血漿樣品,考察室溫放置4 h,-20℃凍融2次(每次間隔24 h),-20℃放置10 d,20 d,30 d后,樣品處理后的穩(wěn)定性(n=3),柚皮苷生物樣品室溫穩(wěn)定性RSD為7.43%、5.52%、3.38%。柚皮素生物樣品室溫穩(wěn)定性RSD為0.85%、1.15%、1.37。柚皮苷生物樣品凍融穩(wěn)定性RSD為13.45%、8.54%、0.80%。柚皮素生物樣品凍融穩(wěn)定性RSD為1.05%、2.85%、4.55%。柚皮苷在-20℃放置10 d,20 d,30 d的穩(wěn)定性RSD為9.76%、5.68%、9.45%。柚皮素在-20℃放置10 d,20 d,30 d的穩(wěn)定性RSD為9.63%、6.62%、6.77%。結(jié)果表明:含藥生物樣品于室溫放置4 h、于-20℃下反復凍融2次后、于-20℃放置30天穩(wěn)定性良好。

    4.4.7 血漿樣品測定

    本試驗根據(jù)藥效試驗所用劑量,在安全、有效的劑量范圍內(nèi),設計了大鼠靜脈注射給藥柚皮苷 45 mg·kg-1,于給藥后預定時間點取血,按4.3.1項下操作,制備血漿樣品并進行測定,測定結(jié)果用DAS 2.0軟件的統(tǒng)計距進行計算。結(jié)果見表3,表4,圖2。

    結(jié)果表明,大鼠靜脈注射柚皮苷原料后,在大鼠體內(nèi)迅速檢測到柚皮苷,其達峰時間Tmax為5 min,達峰濃度Cmax為56583.33 ng·ml-1,達峰后血藥濃度迅速下降??蓹z測到少量的游離和葡萄糖醛酸結(jié)合物形式存在的柚皮苷代謝產(chǎn)物柚皮素,其柚皮素結(jié)合物的達峰時間Tmax為12 h,達峰濃度Cmax為653.68ng·ml-1。可見柚皮苷在大鼠體內(nèi)可部分轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物柚皮素,且主要是以葡萄糖醛酸結(jié)合物形式存在。

    5 討論

    本研究在方法學考察中分別考察了甲醇和水、甲醇和0.1%甲酸、甲醇和醋酸銨的混合溶液等幾種流動相,結(jié)果表明流動相為甲醇:醋酸銨(2 mmol·L-1)=65:35時,柚皮苷、柚皮素在液質(zhì)上可達到基線分離,且在此條件下離子對較為穩(wěn)定,信號強度較高,峰形較好。

    研究表明乙酸乙酯對黃酮類化合物的提取較理想,柚皮苷和柚皮素屬于二氫黃酮苷,本研究根據(jù)二者的理化性質(zhì),選擇乙酸乙酯作提取溶劑,并對文獻報道的方法進行了改進,將多次提取改為單次大體積提取,此法簡單易行,提取率穩(wěn)定,能滿足體內(nèi)低濃度藥物的測定和藥代動力學研究。

    本研究曾使用了甲醇蛋白沉淀法,發(fā)生信號抑制,無離子對信號,基質(zhì)干擾嚴重。還嘗試了乙酸乙酯提取前加入飽和NaCO3,飽和NH4Ac,0.1 mol·ml-1HCl進行鹽析處理,使用乙酸乙酯:正丁醇(1:1),乙酸乙酯:正丁醇(1:2),乙酸乙酯:正丁醇(95:5),乙酸乙酯:異丙醇(95:5)混合溶劑進行提取,均未得到改善提取率的效果,與其它樣品前處理方法(如:蛋白沉淀法等)相比,該液-液提取法給LC/MS/MS分析帶來的基質(zhì)效應(matrix effects)干擾相對較少。

    從藥時曲線可以看出,靜脈注射柚皮苷原料后在大鼠體內(nèi)并非大部分轉(zhuǎn)化為柚皮素,大部分仍然以柚皮苷的形式存在。靜脈注射柚皮苷原料后,柚皮苷的血藥濃度5 min達峰,消除很快,而代謝產(chǎn)物柚皮素主要是以葡糖醛酸結(jié)合物形式存在,幾乎測不到游離的柚皮素,柚皮素葡萄糖醛酸結(jié)合物的血藥濃度12 h達峰。

    參考文獻

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    第一作者簡介:郭俐麟,碩士研究生,從事藥物分析研究。

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