別嘌醇抑制黃嘌呤氧化酶對(duì)缺氧和高氧大鼠心率變異性的影響*

黃永躍, 宋迎婧

1臨海市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科(浙江臺(tái)州 317000)； 2臨海市中醫(yī)院心內(nèi)科(浙江臺(tái)州 317000)

心率變異性(HRV) 是目前基于臨床方法定量評(píng)價(jià)自主神經(jīng)功能的一種無創(chuàng)性指標(biāo)，它能夠客觀地反映交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)的活性變化及兩者的均衡性及其對(duì)心血管活動(dòng)的影響。雖然HRV參數(shù)的生理意義尚未完全闡明[1]，但傳統(tǒng)的心率變異時(shí)域和頻域分析方法為測(cè)量迷走神經(jīng)張力和交感神經(jīng)放電量提供了可靠的手段[1-2]。研究表明活性氧在動(dòng)脈氧壓方面起巨大作用，且能夠影響心臟的自主調(diào)節(jié)[3]。而黃嘌呤氧化酶(XO)在嘌呤新陳代謝中扮演重要角色，且是活性氧的主要內(nèi)源性來源，在缺氧狀態(tài)下其含量將會(huì)上升，從而引起氧化應(yīng)激。別嘌醇抑制XO活性可以減少氧化應(yīng)激，防止氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷以及缺血性并發(fā)癥[4]。已有研究表明別嘌醇可以緩解血管損傷、炎癥、心力衰竭和缺血心肌[4-6]。但別嘌醇對(duì)大鼠HRV的影響及XO如何抑制心率神經(jīng)源性的調(diào)節(jié)尚不明確。為此，2018年2月至2019年2月期間，本研究基于HRV分析技術(shù)，探討別嘌醇標(biāo)準(zhǔn)常壓條件下，以及控制在缺氧和高氧條件下激活或抑制外周化學(xué)反射時(shí)對(duì)大鼠HRV的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠(350 g) 16只。自由攝食飲水，標(biāo)準(zhǔn)的大氣條件下保持12 h∶12 h的明暗循環(huán)。自適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境飼養(yǎng)1周，戊巴比妥鈉 (50 mg/kg)腹腔麻醉大鼠。

1.2 大鼠缺氧、高氧控制 大鼠置于明聚碳酸酯室內(nèi)，通過自動(dòng)可調(diào)壓力調(diào)節(jié)器創(chuàng)造低壓缺氧或高氧的條件。由PowerLab 26T壓力傳感器監(jiān)測(cè)室內(nèi)的壓力。通過高阻氣流PE-10管與外部環(huán)境連接(Clay-Adams, Parsippany, USA)給實(shí)驗(yàn)中聚碳酸酯室提供穩(wěn)定的CO2張力。上述大鼠連續(xù)3 d接受了4個(gè)階段的實(shí)驗(yàn)(4 h)：(1)常壓常氧(即基線條件)，大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)大氣壓條件下保持良好通風(fēng)的室中1 h；(2)低壓缺氧(激活化學(xué)反射和喚起氧化應(yīng)激)，大鼠置于可控制的低壓缺氧條件1 h；(3)常壓高氧(抑制化學(xué)反射反應(yīng))，大鼠置于常壓高氧條件1 h，室內(nèi)氧氣濃度至少充滿90%；(4)復(fù)氧(標(biāo)準(zhǔn)常壓條件下恢復(fù))，大鼠重新置于室內(nèi)通風(fēng)、常壓常氧條件下1 h。

1.3 分組 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和別嘌醇組，每組8只。別嘌醇組注射二甲基亞砜(DMSO, Sigma, St. Louis, USA；別嘌醇溶劑)，置于聚碳酸酯室內(nèi)，接受上述4 h的實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行心率變異性(HRV)分析后，腹腔注射XO抑制劑別嘌醇(50 mg/kg)。次日，開始實(shí)驗(yàn)前注射相同溶劑，而對(duì)照組則給予等體積的生理鹽水，進(jìn)行HRV分析。每次給藥前，在DMSO中重新配置別嘌醇。

1.4 血漿蛋白氧化試驗(yàn) 蛋白質(zhì)羰基含量使用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法測(cè)定。將血漿樣本(100 μL)與100 μL 與含2,4-二硝基苯肼的 HCl 溶液(20 mmol/L) 混合后室溫孵育60 min后再添加500 μL 20%三氯乙酸震蕩以1 000×g離心7 min，棄上清。由上述過程所得的蛋白沉淀物用1 mL體積比為1∶1的乙醇、乙酸乙酯混合溶液洗滌3次并再次離心。去上清液后用1 mL，10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 6.5，含6 mol/L鹽酸胍)重新配制，將混合物在50℃條件下連續(xù)振蕩至顆粒溶解后，分別在280 nm 和360 nm波長(zhǎng)下測(cè)定蛋白質(zhì)和羰基含量。

1.5 血脂過氧化試驗(yàn) 血漿8-異前列腺素F2α(8-ios-PGF2α)濃度測(cè)定則根據(jù)說明書使用抗原競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試劑盒(Cayman Chemicals, Ann Arbor, USA)檢測(cè)。

1.6 抗氧化酶活性測(cè)定 根據(jù)說明書，分別使用Cayman檢測(cè)試劑盒對(duì)XO、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT) 進(jìn)行活性評(píng)估。

1.7 HRV分析 使用PowerLab 26T記錄高分辨率(4 kHz)心電圖(ECG)對(duì)所有QRS復(fù)合波進(jìn)行檢查。采用心電自動(dòng)r峰檢測(cè)進(jìn)行RR間期(RRi)鑒定。由專用軟件Kubios Pro 2.0進(jìn)行自動(dòng)糾正RR間隔或零星的偽峰值相差超過3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)值。采用λ=2 000的HRV光譜，以此來分析之前的濾波數(shù)據(jù)集。校正 RRi-時(shí)間序列后，得到正常的RR區(qū)間，使用KubiosPro 2.0軟件和Microsoft Excel進(jìn)行HRV分析，得到心率變異的時(shí)域指標(biāo)RR間期標(biāo)準(zhǔn)差(SDNN)和相鄰RR間期差的均方根(rMSSD)和頻域指標(biāo)的低頻(LF)、高頻(HF)和總功率譜(TSP)及低高頻比(LF/HF)值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Statistica 12和GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)對(duì)所有數(shù)據(jù)組進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，依據(jù)數(shù)據(jù)呈正態(tài)或非正態(tài)分布，采用Mann-Whitney、Wilcoxon檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 別嘌醇對(duì)抗氧化酶活性的影響 在注射別嘌醇(50 mg/kg)的大鼠體內(nèi)，XO活性與對(duì)照組相比降低了87%，見表1。與對(duì)照組相比，別嘌醇組SOD活性顯著升高(P=0.038)，別嘌醇組CAT或GPx活性增加趨勢(shì)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.117，P=0.058)。

2.2 別嘌醇對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響 別嘌醇組較對(duì)照組血漿中8-ios-PGF2α濃度顯著降低(P=0.008)，然而XO抑制并未導(dǎo)致血漿蛋白羰基的相關(guān)變化(P=0.147)。見表1。

項(xiàng)目對(duì)照組別嘌呤醇組P值XO活性(×105 U/mg)2.50±0.500.32±0.18<0.001SOD活性(×105 U/mg)2.53±0.234.51±0.620.038CAT活性(×104 U/mg)5.18±0.287.01±1.260.117GPx活性(×104 U/mg)8.56±1.8611.53±2.360.0588-ios-PGF2α(pg/mL)136.16±38.6276.53±21.100.008蛋白羰基濃度(nmol/mg)1.10±0.061.23±0.110.147

2.3 缺氧或高氧對(duì)具有XO活性大鼠的HRV的影響 在別嘌醇給藥前，對(duì)照組與作為別嘌醇溶劑的DMSO組的HRV對(duì)缺氧、高氧或恢復(fù)正常氧的反應(yīng)相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察到缺氧和高氧都會(huì)影響大鼠的HRV，缺氧后迷走神經(jīng)放電增強(qiáng)，rMSSD顯著升高(P<0.05)， HF顯著升高(P<0.05)，接下來的高氧狀態(tài)下rMSSD和HF均低于缺氧水平(P<0.05)。在缺氧或高氧時(shí)，交感迷走神經(jīng)平衡的時(shí)域SDNN/rMSSD或頻域指標(biāo)LF/HF均有輕微下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4 別嘌醇的調(diào)節(jié)作用 在缺氧或高氧情況下，別嘌醇增強(qiáng)了整體自主神經(jīng)活性，表現(xiàn)在SDNN、TSP和LF較別嘌醇給藥前顯著增加(P<0.05，P<0.01)，副交感神經(jīng)驅(qū)動(dòng)也增強(qiáng)，rMSSD和HF增加(P<0.05)。自主平衡指標(biāo)LH/HF和SDNN/rMSSD則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在控制的低壓缺氧和高氧條件下，抑制XO能顯著影響心律的神經(jīng)源性調(diào)節(jié)。別嘌醇組整體自主控制顯著增加，包括在缺氧條件下迷走神經(jīng)驅(qū)動(dòng)的增加，以及在隨后的高氧狀態(tài)下下降。因?yàn)檫@種調(diào)節(jié)反應(yīng)能夠控制廣泛迷走神經(jīng)放電的固有竇房結(jié)起搏器優(yōu)勢(shì)神經(jīng)源性，而后者是穩(wěn)定心律的先決條件，且可預(yù)防室性心律失常[7-8]。

HRV分析已經(jīng)在人類研究和臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用[3]，大多數(shù)研究都關(guān)注心臟神經(jīng)源性調(diào)節(jié)的非侵入性評(píng)價(jià)，僅有少數(shù)研究關(guān)注抗氧化劑的調(diào)節(jié)作用。大鼠的HRV光譜與人類的相似，顯示出兩個(gè)主要的頻率成分：低頻和高頻[9]。在本研究中，HRV在時(shí)域和頻域的分析表明XO抑制對(duì)缺氧和高氧刺激引起的HRV變化的方向是相同的。在對(duì)照組中，SDNN和TSP在缺氧狀態(tài)下升高，而在高氧狀態(tài)下降低，而XO抑制后較對(duì)照組在缺氧和高氧中呈現(xiàn)相同上升趨勢(shì)。雖然缺氧和缺氧后高氧均可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[10-11]，但在缺氧或高氧狀態(tài)下HRV變化的不同方向與缺氧化學(xué)感受器激活后的高氧抑制一致[12]。高TSP或SDNN表明心臟可以很容易地應(yīng)對(duì)循環(huán)需求的改變，如血壓升高、運(yùn)動(dòng)等[13]。整體HRV較低與心血管預(yù)后不良有關(guān)，這表明心律控制松散，高度依賴于局部固有的自律細(xì)胞以隨機(jī)模式放電。與以SDNN和TSP為代表的整體HRV的變化相似，別嘌醇在缺氧時(shí)顯著增加副交感神經(jīng)活動(dòng)的rMSSD和HF，在高氧時(shí)也有增加。XO抑制對(duì)缺氧和高氧的交感迷走神經(jīng)均沒有顯著影響，它并沒有影響HRV指標(biāo) LF/HF和SDNN/rMSSD。

RRi的進(jìn)一步增加表明迷走神經(jīng)對(duì)竇房結(jié)起搏點(diǎn)的支配性增強(qiáng)，與LF/HF和SDNN/rMSSD比值的適度增加有關(guān)，這與交感神經(jīng)增益相反。這種不一致的可能解釋是在交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)傳出物同時(shí)顯著激活的情況下，從HRV數(shù)據(jù)來看(LF和HF均顯著增加)，交感神經(jīng)對(duì)心率的影響可以忽略不計(jì)。這與之前的一項(xiàng)研究相一致，清醒大鼠的缺氧并未引起腰神經(jīng)活動(dòng)的相關(guān)變化[14]。早期的報(bào)道有關(guān)大鼠對(duì)缺氧的心率反應(yīng)并不一致，有文獻(xiàn)記載大鼠缺氧后心率升高或無變化或降低[15-16]。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道大鼠對(duì)缺氧的心率反應(yīng)大多來自于手術(shù)后應(yīng)激、麻醉或相對(duì)較高的基礎(chǔ)交感神經(jīng)張力[17]。

本研究結(jié)果表明抑制XO可減少氧化應(yīng)激，但對(duì)蛋白羰基無影響，表明血漿蛋白不是XO衍生ROS的主要靶點(diǎn)。另一方面，在大鼠模型上已證實(shí)異丙腎上腺素起源的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致心肌損傷與糖尿病[18]，別嘌醇可能同時(shí)影響脂類的結(jié)構(gòu)以及后續(xù)血清和心臟中的脂類和蛋白質(zhì)的功能。由于本研究主要關(guān)注的是神經(jīng)源性調(diào)節(jié)機(jī)制，而不是心臟起搏器的內(nèi)在活動(dòng)，因此實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注與血漿相關(guān)的氧化應(yīng)激。在缺氧/高氧實(shí)驗(yàn)后，XO抑制劑引起了酶抗氧化防御作用的增加。SOD、CAT和GPx是細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的重要酶，大鼠在注射別嘌醇后SOD、CAT和GPx活性都呈增加趨勢(shì)，與最近關(guān)于別嘌醇對(duì)接受缺血性再灌注損傷大鼠的影響的相關(guān)研究一致[19]。

項(xiàng)目常氧缺氧高氧復(fù)氧RRi(ms) 對(duì)照組190±7.72206±10.12222±4.76? 209±4.25? DMSO(別嘌醇注射前)181±5.58 211±8.35?217±7.41??203±9.90? 別嘌醇組185±4.45 239±5.96??△219±4.04??210±4.92??△SDNN(ms) 對(duì)照組4.03±0.354.41±0.803.16±0.37?4.98±0.60 DMSO(別嘌醇注射前)4.23±0.696.08±1.122.72±0.40?4.11±0.60 別嘌醇組4.13±0.3511.36±0.66?△4.94±0.25△#4.55±0.40rMSSD(ms) 對(duì)照組3.53±0.354.14±0.742.84±0.434.63±0.80 DMSO(別嘌醇注射前)3.29±0.455.39±0.59?2.58±0.313.73±0.59 別嘌醇組3.41±0.267.76±0.46?△4.71±0.24?△4.18±0.46SDNN/rMSSD 對(duì)照組1.17±0.091.09±0.091.17±0.131.18±0.14 DMSO(別嘌醇注射前)1.26±0.051.10±0.131.04±0.041.13±0.06 別嘌醇組1.32±0.041.19±0.071.11±0.06?1.16±0.07TSP(ms2) 對(duì)照組16.15±2.1119.44±6.647.81±1.23??20.67±3.51 DMSO(別嘌醇注射前)19.72±7.2029.94±7.026.90±2.3114.42±3.95 別嘌醇組17.94±3.42138.34±14.57??△15.35±1.19△19.04±2.42LF(ms2) 對(duì)照組2.43±0.132.55±0.981.25±0.35?4.06±0.90 DMSO(別嘌醇注射前)4.18±1.635.75±1.841.68±0.684.65±1.15 別嘌醇組3.30±0.7738.56±4.03△△2.86±0.35??△4.36±0.66HF(ms2) 對(duì)照組3.73±0.744.16±1.242.32±0.646.53±1.76 DMSO(別嘌醇注射前)3.52±1.206.37±1.091.66±0.315.04±1.48 別嘌醇組3.62±0.6418.27±1.80??△6.99±0.33△#5.79±1.05LF/HF 對(duì)照組0.84±0.180.64±0.140.81±0.370.87±0.25 DMSO(別嘌醇注射前)1.17±0.131.03±0.430.90±0.231.18±0.30 別嘌醇組1.28±0.311.54±0.711.16±0.201.13±0.18

注：與常氧狀態(tài)比較 *P<0.05，**P<0.01；與DMSO(別嘌醇注射前)比較 △P<0.05，△△P<0.01; #與高氧狀態(tài)比較P<0.05

大鼠基礎(chǔ)XO活性遠(yuǎn)高于人類，但其作為氧化劑的破壞性作用也遠(yuǎn)高于人類[20]。然而，研究數(shù)據(jù)表明，在缺血或缺血后再灌注期間，XO產(chǎn)生的ROS迅速增多，因此XO被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的重要觸發(fā)因素。綜上所述，別嘌醇可降低意識(shí)不受約束大鼠缺氧和缺氧后高氧引起的氧化應(yīng)激。在標(biāo)準(zhǔn)的常氧條件下，XO抑制作用可能不干擾神經(jīng)源性心臟調(diào)節(jié)。然而別嘌醇作為氧化劑干擾氧傳感激活化學(xué)反射的概念并沒有得到相關(guān)數(shù)據(jù)的支持。此外，在缺氧條件下，當(dāng)化學(xué)反射被激活時(shí)，XO抑制劑別嘌醇增強(qiáng)了自主神經(jīng)對(duì)心率的影響，增加了迷走神經(jīng)的作用，為在缺氧條件下使用XO抑制劑提供了依據(jù)。