高酰基結(jié)冷膠對(duì)乳清分離蛋白熱誘導(dǎo)凝膠特性的影響

郭娜，宋苗苗，徐忠東，朱桂蘭，何云昆，余振宇，馬瀅

1(合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥，230061) 2(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥，230006)

食品中的蛋白質(zhì)和多糖通過(guò)氫鍵、疏水相互作用、范德華力、離子橋聯(lián)或共價(jià)鍵等形成具有一定三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)的連結(jié)，形成具有獨(dú)特的質(zhì)地結(jié)構(gòu)和感官特性的凝膠，如豆腐、肉皮凍、果凍[1-4]。蛋白-多糖凝膠的研究擴(kuò)大了蛋白與膠的使用范圍，為食品的研究和發(fā)展開(kāi)辟了一條新的渠道。蛋白通過(guò)受熱變性后結(jié)構(gòu)展開(kāi)，分子凝聚形成具有三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠，蛋白質(zhì)的兩性結(jié)構(gòu)及凝膠形成的網(wǎng)絡(luò)空間也為包載花青素、姜黃素等生物活性物質(zhì)提供了空間[5-8]。乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)是是乳清經(jīng)過(guò)濃縮精制得到的蛋白質(zhì)，具有一定營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性，常作為一種食品添加劑來(lái)提高食品的凝膠、乳化等功能特性[9]。高酰基結(jié)冷膠(high acyl gellan gum，HG)是一種微生物多糖，其形成的凝膠黏彈且柔軟，且受Ca2+等離子影響較小，在乳品及果汁飲料中作為增稠劑和穩(wěn)定劑使用[10-12]。

乳清蛋白與藍(lán)莓果膠通過(guò)靜電作用形成的復(fù)合物，能夠提高復(fù)合物的黏度，并促進(jìn)蛋白質(zhì)-藍(lán)莓果泥的穩(wěn)定性[13]。酸化牛奶中酪蛋白與結(jié)冷膠結(jié)合可以形成連續(xù)的凝膠網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)了復(fù)合物的質(zhì)地特性[14]。結(jié)冷膠作為復(fù)配膠的材料成為食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，它可溶解在熱牛奶中，冷卻時(shí)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以懸浮巧克力牛奶飲料中的可可粉微粒，并能夠穩(wěn)定奶昔、冰淇凌；在生物醫(yī)學(xué)方面，通過(guò)封裝活性原料用于藥物控制釋放[15-16]。

目前改進(jìn)凝膠形成方式，開(kāi)發(fā)新型的凝膠產(chǎn)品，受到極大關(guān)注。本論文采用乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)、高?；Y(jié)冷膠為材料，制備乳清分離蛋白-高酰基結(jié)冷膠混合凝膠(WPI-HG)，分析乳清分離蛋白和高酰基結(jié)冷膠的相互作用，為拓展乳清分離蛋白和多糖的新型凝膠食品，提高傳統(tǒng)食品的質(zhì)量，改善食品的加工工藝提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高?；Y(jié)冷膠(食品級(jí))，美國(guó)唐瑞斯食品物料公司；乳清分離蛋白(WPI9410)，美國(guó)希里瑪公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2，金壇市瑞爾電器有限公司；HC-3018R冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro Systems公司；Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Nicolet公司；鎢燈絲掃描電子顯微鏡EVO MA15，德國(guó)卡爾蔡司股份公司；HAAKE RS6000型流變儀，賽默飛世爾科技公司；UV1800紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 混合凝膠配制

分別配制200 g/L的乳清分離蛋白溶液和10 g/L的高?；Y(jié)冷膠溶液，放置4 ℃條件下過(guò)夜備用。按照不同比例配制乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠溶液(WPI-HG)，使混合液中乳清分離蛋白含量為100 g/L，高?；Y(jié)冷膠質(zhì)量濃度分別為1、1.5、2、2.5、3和4 g/L[分別為WPI+HG(1 g/L)、WPI+HG(1.5 g/L)、WPI+HG(2 g/L)、WPI+HG(2.5 g/L)、WPI+HG(3 g/L)、WPI+HG(4 g/L)]，并在95 ℃加熱0.5 h，冷卻后4 ℃下穩(wěn)定20 h，形成凝膠。

1.3.2 凝膠強(qiáng)度(gel strength)

采用質(zhì)構(gòu)儀分析凝膠強(qiáng)度。使用P 0.5探頭，測(cè)前、中、后速度為1 mm/s，感應(yīng)力為3 g。平行測(cè)量3次。

1.3.3 凝膠保水性(water holding capacity)

將樣品在10 000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，用定性濾紙吸去水分。測(cè)定樣品離心前后質(zhì)量，按公式(1)計(jì)算保水率：

(1)

式中：w，凝膠保水率，%；m0，離心前凝膠質(zhì)量，g；m1，離心后凝膠質(zhì)量，g。

1.3.4 凝膠透光率(transmittance)

將凝膠放置于1 cm比色管中，測(cè)其在620 nm處的透光率。

1.3.5 游離巰基分析

使用Tris-Gly將樣品稀釋至蛋白含量1 mg/mL，8 000 r/min離心15min，取3 mL上清液并加入30 μL DTNB溶液，混勻后反應(yīng)15 min，測(cè)定412nm處吸光度，采用公式(2)計(jì)算游離巰基含量：

(2)

式中：δ，游離巰基含量，μmol/g 蛋白；A412，412 nm處的吸光度值；D，稀釋倍數(shù)；ρ，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.6 流變學(xué)性質(zhì)測(cè)定

動(dòng)態(tài)溫度掃描參數(shù)設(shè)定：溫度變化范圍25～95 ℃，升溫速度為2 ℃/min，保持10 min，降溫速率4 ℃/min，掃描應(yīng)變?yōu)?.01%，掃描頻率為1 Hz，每個(gè)樣品做3次平行，使用甲基硅油密封。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析

樣品冷凍干燥后，采用KBr壓片后使用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描檢測(cè)，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.8 掃描電子顯微鏡分析

樣品冷凍干燥后，噴金后采用鎢燈絲電子掃描電鏡觀察。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用軟件Origin 9和SPSS 24對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，顯著性差異分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行，顯著水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高?；Y(jié)冷膠濃度對(duì)混合凝膠形成的影響

制備的乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠混合凝膠圖片如圖1所示。由圖1可知，高酰基結(jié)冷膠對(duì)混合凝膠的形成具有顯著作用，隨著高?；Y(jié)冷膠濃度增大，混合凝膠的外觀結(jié)構(gòu)逐步穩(wěn)定，在高?；Y(jié)冷膠質(zhì)量濃度3 g/L時(shí)，能夠形成穩(wěn)定的凝膠。

a-WPI+HG(1 g/L);b-WPI+HG(1.5 g/L);c-WPI+HG(2 g/L);d-WPI+HG(2.5 g/L);e-WPI+HG(3 g/L);f-WPI+HG(4 g/L)圖1 乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠混合凝膠圖片F(xiàn)ig.1 Visual observation of WPI-HG gels

2.2 高酰基結(jié)冷膠質(zhì)量濃度對(duì)混合凝膠硬度的影響

高?；Y(jié)冷膠質(zhì)量濃度對(duì)乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠混合凝膠的凝膠強(qiáng)度影響如圖2所示。從圖2可以看出，高?；Y(jié)冷膠濃度對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響顯著。隨著高?；Y(jié)冷膠濃度的增加，混合凝膠的強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，在4 g/L時(shí),凝膠強(qiáng)度最大，為26.97 g，表明高?；Y(jié)冷膠可以提高乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠混合凝膠的凝膠強(qiáng)度。

圖2 乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠混合凝膠的強(qiáng)度Fig.2 The gel strength of WPI-HG gels

2.3 高酰基結(jié)冷膠濃度對(duì)混合凝膠保水性的影響

高?；Y(jié)冷膠對(duì)混合凝膠的保水性影響如圖3所示。隨著高?；Y(jié)冷膠添加量的增加，混合凝膠的保水性明顯上升，其中高酰基結(jié)冷膠為2.5 g/L時(shí)，保水性最大，為97.41%，這可能是高?；Y(jié)冷膠富含大量親水基團(tuán)，能夠結(jié)合大量水分子，且形成的乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠混合凝膠具有一定的網(wǎng)絡(luò)，也增加了對(duì)水分的束縛作用。這一結(jié)果與魔芋葡甘聚糖-咸蛋清蛋白混合凝膠等的凝膠特性一致[17-19]。

圖3 乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠混合凝膠的保水性Fig.3 The water holding capacity of WPI-HG gels

2.4 高?；Y(jié)冷膠濃度對(duì)混合凝膠透光率的影響

高?；Y(jié)冷膠對(duì)混合凝膠的透過(guò)光率影響如圖4所示。

圖4 乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠混合凝膠的透光率Fig.4 The transittance of WPI-HG gels

由圖4可以看出，隨著高?；Y(jié)冷膠質(zhì)量濃度的增大，混合凝膠的透光率逐漸降低，這可能是隨著高?；Y(jié)冷膠濃度增加，形成的混合凝膠結(jié)構(gòu)更加精密所致。

2.5 游離巰基分析

游離巰基形成的二硫鍵能夠有效增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間作用力，對(duì)凝膠的形成具有重要作用[19]，如圖5所示。

圖5 乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠溶液和凝膠的巰基含量Fig.5 Free SH contents of solution and gel

未加熱的混合溶液中巰基含量隨著高?；Y(jié)冷膠含量增大而顯著增加(P<0.05)，加熱后的凝膠中巰基含量顯著降低。說(shuō)明乳清分離蛋白與高?；Y(jié)冷膠的結(jié)合，阻礙了蛋白質(zhì)游離巰基間的結(jié)合，從而提高了溶液中游離巰基含量；加熱凝膠化過(guò)程中游離巰基相結(jié)合形成二硫鍵，且隨著高?；Y(jié)冷膠含量增加，游離巰基減少，形成的二硫鍵增多，這也與凝膠強(qiáng)度增大結(jié)果一致。

2.6 混合凝膠溶液的流變學(xué)特性

溫度掃描能夠反應(yīng)凝膠形成過(guò)程中的動(dòng)態(tài)黏彈性變化，儲(chǔ)能模量G′值能夠反應(yīng)樣品的彈性特性或材料的固體樣性質(zhì)，耗損模量G″反應(yīng)樣品的黏性特性[20]。乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠溶液的溫度掃描結(jié)果如圖6所示。

A-WPI溶液；B-WPI+HG(1 g/L)溶液；C-WPI+HG(2 g/L)溶液；D-WPI+HG(2.5 g/L)溶液；E-WPI+HG(3 g/L)溶液；F- WPI+HG(4 g/L)溶液；G- HG(4 g/L)溶液圖6 乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠溶液的流變性質(zhì)Fig.6 Temperature scan of composites during thermal gelation

由圖6-A、圖6-B、圖6-C和圖6-G可以看出，溶液的G″均大于G′，說(shuō)明這幾種溶液主要表現(xiàn)為液體的粘性特性。從圖6-D、圖6-E、圖6-F可以看出，隨著高?；Y(jié)冷膠添加量增加，其黏彈性發(fā)生明顯變化，在1 000 s后，G′均明顯增大，說(shuō)明開(kāi)始形成蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)，在2 600 s后，G′顯著上升，且大于G″值，說(shuō)明此時(shí)體系發(fā)生相變，表現(xiàn)為固體的彈性特性；添加2.5 g/L高?；Y(jié)冷膠發(fā)生相變的時(shí)間約2 700 s，添加3.0 g/L高?；Y(jié)冷膠的體系需要2 830 s，添加4 g/L高酰基結(jié)冷膠的體系需要約3 060 s，這說(shuō)明了高酰基結(jié)冷膠能夠促使乳清分離蛋白形成熱凝膠，且隨著含量增加其形成穩(wěn)定凝膠所需時(shí)間增加，也說(shuō)明提高高?；Y(jié)冷膠含量可以提高乳清分離蛋白相轉(zhuǎn)變溫度。

2.7 混合凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

混合凝膠的顯微結(jié)構(gòu)電鏡圖如圖7所示?？梢钥闯?，高?；Y(jié)冷膠呈現(xiàn)孔徑較大的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且空隙不規(guī)則；乳清分離蛋白呈不規(guī)則片狀，且有非常明顯的蛋白質(zhì)顆粒[21]。乳清蛋白-高?；Y(jié)冷膠混合凝膠呈現(xiàn)緊密堆疊結(jié)構(gòu)，且隨著高?；Y(jié)冷膠濃度的增大，形成孔徑較小的立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這也為負(fù)載生物活性物質(zhì)提供了空間。

a-HG;b-WPI;c-WPI+HG(2 g/L);d-WPI+HG(3 g/L);e-WPI+HG(4 g/L)圖7 顯微結(jié)構(gòu)觀察Fig.7 SEM of the microstructure

2.8 混合凝膠的FTIR分析

a-HG;b-WPI;c-WPI+HG(2 g/L);d-WPI+HG(3 g/L);e-WPI+HG(4 g/L)圖8 紅外光譜分析Fig.8 FTIR spectra

3 結(jié)論

本文研究了高?；Y(jié)冷膠濃度對(duì)乳清分離蛋白-高?；Y(jié)冷膠復(fù)合凝膠的影響，結(jié)果表明混合凝膠的凝膠強(qiáng)度和保水性均優(yōu)于乳清分離蛋白凝膠，且隨著高酰基結(jié)冷膠濃度增大而增大，高酰基結(jié)冷膠的濃度為3 g/L時(shí)，可形成形態(tài)穩(wěn)定的混合凝膠；濃度為4 g/L時(shí)，復(fù)合凝膠的凝膠強(qiáng)度最大為26.97 g，保水性最好為97.41%，透光率最低為1.87%。高?；Y(jié)冷膠增加了乳清分離蛋白溶液的游離巰基含量，有利于加熱形成二硫鍵，增強(qiáng)凝膠結(jié)構(gòu)，且高?；Y(jié)冷膠含量增加可以提高混合凝膠相轉(zhuǎn)變溫度。紅外光譜結(jié)果表明乳清分離蛋白與高?；Y(jié)冷膠之間存在分子間作用力，微觀結(jié)構(gòu)表明復(fù)合凝膠形成結(jié)構(gòu)均勻的立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。