基于高通量測序與培養(yǎng)方法分析新鮮佛手與老香黃中的細菌多樣性

戈子龍，張澤金，周愛梅，陳松，鐘青萍*

1(廣東省食品質(zhì)量與安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州,510642)2(廣東展翠食品股份有限公司，廣東 潮州,521000)

佛手(CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle) 又名佛手柑、五指橘，為蕓香科柑橘屬植物香櫞的變種，因其形如手指故得名[1]。佛手藥食同源，在我國種植和藥用歷史悠久，早在《本草綱目》[2]中就有記載，佛手柑“下氣，除心頭痰水；煮酒飲，治痰多咳嗽；煮湯，治心下氣痛”。成熟的佛手中含有黃酮類、多酚、香豆素、活性多糖、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等多種成分[3-4]，具有和胃健脾、舒肝理氣、止咳化痰、抗腫瘤等多種生理功效[5-6]。由佛手果經(jīng)歷九蒸九曬后制成的色黑如漆、綿軟適口的老香黃是潮汕地區(qū)特有的藥用涼果，受到潮汕人民的青睞[7]。其具有消積祛風(fēng)、開胃理氣、化痰生津等多種功效，而且久藏不壞，隨著貯藏時間的延長其藥效越佳[8]。

對樣品中微生物的分析鑒定，傳統(tǒng)的方法是先對樣品中的微生物進行富集培養(yǎng)，然后分離培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)物，再對其進行形態(tài)觀察和生理生化反應(yīng)鑒定，或提取純培養(yǎng)物的DNA結(jié)合一代16S rRNA基因測序并與菌種庫序列進行比對得出結(jié)論。但由于培養(yǎng)條件、微生物營養(yǎng)要求等方面的限制，能夠培養(yǎng)的微生物往往只占其中所有微生物的很小一部分，因而傳統(tǒng)純培養(yǎng)的分析結(jié)果不能完全反映樣本中微生物菌群情況。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，高通量測序在微生物菌群的研究表現(xiàn)出越來越突出的優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境水土污染[9-10]、食品[11]、人體胃腸道[12]等多個方面。與傳統(tǒng)分離鑒定方法相比，高通量測序技術(shù)無需經(jīng)過微生物分離培養(yǎng)過程而是直接在分子層面進行測序，它既可以檢出難以培養(yǎng)的優(yōu)勢微生物，還能確定樣品中大多數(shù)微生物的相對豐度[13-14]。

老香黃作為佛手的腌制品，腌制年限越久藥效越佳。但目前國內(nèi)外尚無對老香黃的微生物多樣性進行分析，為了初步了解加工前后微生物的變化以及老香黃藥用功效與微生物之間的聯(lián)系，本研究以加工前的佛手鮮果與其腌制品——老香黃為研究對象，采用高通量測序技術(shù)分析加工前后樣品中的菌群組成及其變化，并結(jié)合純培養(yǎng)方法進行分析比較，為老香黃的食用安全性與藥用功效研究提供參考依據(jù)，為佛手的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

佛手鮮果和老香黃由廣東某食品公司提供，以無菌采樣袋采集后置于4 ℃恒溫箱中于12 h內(nèi)運至實驗室，在超凈工作臺內(nèi)進行無菌分割，于-80 ℃下保存。佛手鮮果編號為FF，老香黃編號為EP，編號1、2表示來自不同的鮮果和老香黃樣品。

1.2 方法

1.2.1 微生物的分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1.1 分離培養(yǎng)

配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar, NA)、GAM瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和改良MRS培養(yǎng)基，制作平板備用。分別稱取佛手鮮果和老香黃各10 g，加入90 mL無菌生理鹽水，在無菌條件下勻漿，制成10-1稀釋液，并依次制備10-2、10-3和10-4等稀釋液。取100 μL稀釋液涂布于NA平板，將平板分別置于30 ℃和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h；在厭氧工作站中取100 μL稀釋液涂布于GAM平板、MRS平板和改良MRS平板，于37 ℃無氧條件下培養(yǎng)36～48 h。各稀釋度做3個平行。根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、顏色等形態(tài)學(xué)特征挑取不同的單菌落，并劃線純化培養(yǎng)3次。

1.2.1.2 菌種鑒定

將分離純化后的菌株進行革蘭氏染色和鏡檢觀察。同時采用SDS法提取菌株的DNA，以細菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,出現(xiàn)清晰的條帶，將其送至上海生工進行測序，將所得序列在NCBI上進行序列比對。

1.2.2 高通量測序

1.2.2.1 基因組DNA的提取和PCR擴增

采用CTAB法[15]對樣本的基因組DNA進行提取，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度，取適量的樣本DNA于離心管中，以無菌水稀釋至1ng/μL備用。以稀釋后的基因組DNA為模板，以16S V4區(qū)引物(515F和806R)進行PCR擴增。

515F：5’-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’

806R：5’-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’

1.2.2.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后以1×TAE的2%瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，剪切回收目標條帶，以Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.2.2.3 文庫構(gòu)建和上機測序

采用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建的文庫經(jīng)過Qubit定量和檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進行上機測序(由北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成)。

1.2.2.4 測序數(shù)據(jù)處理與分析

采用Cutadapt先對reads進行低質(zhì)量部分剪切等方法得到原始數(shù)據(jù)(raw reads)，將reads序列通過BugBase[16]與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測嵌合體序列并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(clean reads)。利用Uparse軟件[17]對所有樣品的全部clean reads進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，最后用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對OTUs序列進行物種注釋分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 純培養(yǎng)結(jié)果

在37 ℃下培養(yǎng)的NA平板上從佛手鮮果中分離到7種不同形態(tài)的菌株，將分離的菌株進行革蘭氏染色、形態(tài)學(xué)觀察與16S rRNA基因鑒定，結(jié)果表明分離的細菌以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為主，還有產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、Rhodococcushoagii、Enterobacterasburiae、Glutamicibactercreatinolyticus和假單胞菌(Pseudomonassp.)；老香黃中只分離出了枯草芽孢桿菌。菌落形態(tài)如圖1所示。

a、b、c、d、e、f、g為從鮮果中分離，h為從老香黃中分離的細菌的菌落形態(tài)a-B.subtilis;b-K.aerogenes;c-S.marcescens;d-R.hoagii;e-E.asburiae;f-G.creatinolyticus;g-Pseudomonas sp.;h-B.subtilis圖1 在NA培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)的菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphologies of the strains on NA at 37 ℃

30 ℃下，以NA平板從鮮果中分離出1株菌，經(jīng)鑒定為分散泛菌(Pantoeadispersa)，從老香黃中分離到1株菌，為枯草芽孢桿菌，菌落形態(tài)如圖2所示。GAM平板、MRS平板和改良MRS平板上經(jīng)過36～48 h的培養(yǎng)并未有微生物生長。分離菌株的16S rRNA基因測序及Blast比對結(jié)果見表1，比對相似度均達99%以上。

i-鮮果中分離菌株;j-老香黃中分離菌株圖2 在NA培養(yǎng)基上30 ℃下培養(yǎng)的菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphologies of the strains on NA at 30 ℃

表1 菌株16S rRNA基因比對結(jié)果Table 1 16S rRNA gene alignment results of the strains

2.2 高通量測序分析結(jié)果

2.2.1 測序樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計與OTU分析

對4個樣品16S V4區(qū)測序，采用Ion S5TMXL測序平臺得到295 352條原始數(shù)據(jù)，經(jīng)拼接、過濾，得到有效序列279 199條，其平均長度為417 bp，按照97%相似度分類，對有效數(shù)據(jù)進行聚類，得到678個OTUs，結(jié)果如表2所示,測序所得的有效序列達到細菌多樣性分析的要求。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果Table 2 Statistic results of sequence data

注：FF1、FF2為佛手鮮果，EP1、EP2為老香黃

稀釋性曲線(rarefaction curve)是通過對序列進行隨機抽樣，從樣本中隨機抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計它們所代表物種數(shù)目(即OTUs數(shù)目)。以抽取數(shù)據(jù)量為橫坐標，對應(yīng)的物種數(shù)為縱坐標構(gòu)建曲線，曲線越平坦說明增加更多的測序量只會出現(xiàn)少量的新物種(OTUs)，直接反映測序量是否合理，間接反映物種的豐富程度。等級聚類曲線(rank abundance)是將樣本中的OTUs按相對豐度由大到小排序得到對應(yīng)的排序編號，以O(shè)TUs的排序編號為橫坐標，OTUs中的相對豐度為縱坐標，再將這些點用折線連接，可直觀地反映樣本中物種的豐富度和均勻度。橫向看，豐富度越高曲線跨度越大；縱向看，曲線越平緩，物種分布越均勻[18]。如圖3-A所示，隨著測序數(shù)量的增加，每個樣品的稀釋曲線趨于平坦，在測序量為30 000上基本趨于平坦，說明增加測序量，不會出現(xiàn)新的OTUs或者很少出現(xiàn)新的OTUs。說明本次測序數(shù)據(jù)量合理并且測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的細菌多樣性信息[19]，由圖3-B可知，EP2在橫坐標的跨度最大、曲線最平緩，說明在EP2中細菌的豐富度最高且最均勻。

圖3 稀釋性曲線(A)和等級聚類曲線(B)Fig.3 Rarefaction curve(A)and rank abundance(B)

2.2.2 樣品中所含OTU數(shù)目分析

采用Qiime軟件，得到每個OTU的分類學(xué)信息，通過R軟件，繪制維恩圖。FF1、FF2、EP1和EP2的OTU數(shù)目分別為122、173、179和573，F(xiàn)F1與FF2共有的OTU有97個，EP1與EP2共有的OTU有117個，4種樣品中共有的OTU有44個(圖4)。EP2中所含的OTU數(shù)目最多，按共有OTU的比例來看，F(xiàn)F1與FF2中的OTU共有率比EP1與EP2高，說明FF1與FF2的物種組成更加相近。

圖4 OTU的維恩圖Fig.4 Venn diagram of OTU

2.2.3 Alpha多樣性分析

根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標的Shannon、Simpson、ACE、Chao1及Coverage指數(shù)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。結(jié)果如表3所示，各樣本的Coverage都在0.999及以上，說明覆蓋面達到99.9%，序列沒有被檢出的可能性很小，能夠提供充足的序列進行微生物多樣性分析。樣品EP2的Shannon、Chao1、ACE指數(shù)明顯高于其他3種樣品，說明EP2中細菌多樣性和豐富度高于其他樣品；EP1與EP2同為老香黃，但其細菌的多樣性低于EP2，可見老香黃在加工完成后不同的批次存在著差異，其細菌的多樣性可能與原料鮮果及生產(chǎn)過程中的環(huán)境微生物相關(guān)。

表3 Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index

2.2.4 細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

2.2.4.1 基于門水平的細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

門水平上，相對豐度前10的物種如圖5所示，F(xiàn)F1中相對豐度比較大的主要有變形菌門(Proteobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)，分別占44.6%、35.9%；FF2中有藍細菌門、變形菌門，分別占56.0%、9.7%；EP1中有變形菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，分別占61.4%、32.8%、2.7%和1.4%；EP2中有厚壁菌門、變形菌門、藍細菌門、擬桿菌門、放線菌門和酸桿菌門(Acidobacteria)，分別占42.3%、41.7%、5.3%、3.3%、2.4%和1.6%。佛手鮮果在制作老香黃過程中變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門細菌有所增加，藍細菌門細菌比例減少。變形菌門是細菌中最大的一個門，其均為革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中。許多厚壁菌門的細菌可以產(chǎn)生芽孢，它可以抵抗脫水和極端環(huán)境，并且在很多不同環(huán)境中都可以找到芽孢，這可能是厚壁菌門細菌能在高鹽、高糖的加工品老香黃中仍然出現(xiàn)的原因。KAOUTARI等[20]構(gòu)建以厚壁菌門、擬桿菌門為主要豐度的微生物區(qū)系探究人體腸道微生物內(nèi)碳水化合物活性酶的分布和豐度，結(jié)果顯示，厚壁菌門和擬桿菌門微生物基因主要編碼碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZyme)，而CAZyme的主要功能是分解碳水化合物，因此這可能與老香黃開胃、助消化的功效有關(guān)系。酸桿菌門菌株最早由KISHIMOTO等[2]在1991年從酸性礦山環(huán)境中分離，并于1995年將酸桿菌劃分為新的細菌類群。PANKRATOV等[21]從酸性泥炭土中分離出1株酸桿菌株TPB6017，其具有降解纖維素等多糖類物質(zhì)的功能。但由于大多數(shù)酸桿菌門的微生物處于難以培養(yǎng)的狀態(tài)，目前學(xué)術(shù)界對其自然分布以及生態(tài)功能還不甚了解，多為借助新型的分子生物學(xué)技術(shù)對酸桿菌菌群結(jié)構(gòu)和生理學(xué)特征進行研究。

圖5 門水平上的菌群相對豐度Fig.5 Relative abundance of bacteria at phylum level

2.2.4.2 基于科水平的細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

科水平上，F(xiàn)F1中相對豐度較大的有腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、unidentified Cyanobacteria和unidentified Rickettsiales，分別占40.5%、35.9%和1.2%；FF2中相對豐度較大的有unidentified Cyanobacteria、腸桿菌科、unidentified Rickettsiales，分別占60.0%、6.3%和1.5%；EP1中相對豐度較大的有unidentified Cardiobacteriales、腸球菌科(Enterococcaceae)、unidentified Clostridiales和雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)，分別占57.9%、9.0%、2.6%和1.0%；EP2中相對豐度較大的有unidentified Cardiobacteriales、unidentified Cyanobacteria、腸球菌科、乳桿菌科(Lactobacillaceae)，分別占34.9%、5.3%、4.4%和2.3%(圖6)。經(jīng)加工后的老香黃，鮮果中原有的優(yōu)勢菌科腸桿菌科和unidentified Rickettsiales未檢出，其優(yōu)勢菌科為unidentified Cardiobacteriales、腸球菌科等。此外，老香黃中出現(xiàn)了乳桿菌科和雙歧桿菌科等有益菌。

圖6 科水平上的菌群相對豐度Fig.6 Relative abundance of bacteria at family level

2.2.4.3 基于屬水平的細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

屬水平上，相對豐度前30的菌屬如圖7所示，F(xiàn)F1相對豐度較大的有unidentifiedCyanobacteria、泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、unidentifiedRickettsiales、沙雷氏菌屬(Serratia)分別占35.9%、24.6%、6.1%、3.1%、1.2%和1.1%；FF2中有unidentifiedCyanobacteria(56.0%)、泛菌屬(4.4%)、腸桿菌屬(1.2%)、unidentifiedRickettsiales(1.5%)、芽孢桿菌屬(0.3%)；EP1中有Ignatzschineria(57.9%)、漫游球菌屬(Vagococcus，6.4%)、腸球菌屬(Enterococcus，2.6%)、Anaerosalibacter(2.0%)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium，1.0%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，0.4%)、芽孢桿菌屬(0.2%)；EP2中有Ignatzschineria(34.9%)、unidentifiedCyanobacteria(5.3%)、漫游球菌屬(4.2%)、乳桿菌屬(2.2%)、雙歧桿菌屬(0.5%)、芽孢桿菌屬(0.2%)。老香黃的加工中微生物在屬水平的變化明顯，優(yōu)勢菌從泛菌屬、腸桿菌屬變成Ignatzschineria、漫游球菌屬；而且腸桿菌屬未檢出，其只在鮮果中出現(xiàn)。COLLINS等[22]于1989年首次對漫游球菌屬進行研究分析，發(fā)現(xiàn)河流漫游球菌(Vagococcusfluvialis)的來源廣泛，其形態(tài)特征與腸球菌及其相似。漫游球菌屬包括不同的菌種如：河流漫游球菌、鮭魚漫游球菌(Vagococcussalmoninarum)、水獺漫游球菌(Vagococcuslutrae)和嗜肉漫游球菌(Vagococcuscarniphilus)等，其中既有致病菌株又有非致病菌株。SORROZA等[23]研究發(fā)現(xiàn)河流漫游球菌具有作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中益生菌的潛力。而Ignatzschineria屬細菌是一種致病菌[24]。高通量測序結(jié)果表明老香黃中的Ignatzschineria與漫游球菌屬細菌處于優(yōu)勢地位，這2個菌屬可能給老香黃的食用造成安全隱患，雖然純培養(yǎng)中未發(fā)現(xiàn)，但在老香黃的加工過程中仍需要加強安全衛(wèi)生的管控。此外，老香黃中檢測出雙歧桿菌屬和乳桿菌屬，雙歧桿菌屬是人體腸道菌群中的重要成分，是一類重要的益生菌，它可以調(diào)節(jié)并維持腸道內(nèi)正常微生物的菌群平衡[25]。乳桿菌屬廣泛分布于含有碳水化合物的動植物發(fā)酵產(chǎn)品中，也常見于溫血動物的口腔和腸道內(nèi)，具有改善腸道功能的作用。而且雙歧桿菌屬及乳桿菌屬亦有降血脂的作用[26-27]。老香黃具有的“扶正祛邪、改善機體內(nèi)環(huán)境”的功效可能與這2種益生菌相關(guān)。

圖7 屬水平上的菌群相對豐度Fig.7 Relative abundance of bacteria at genus level

2.2.5 主成分分析(principal component analysis，PCA)

主成分分析是一種基于歐式距離(euclidean distances)的應(yīng)用方差分解，對多維數(shù)據(jù)進行降維，從而提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)的方法[28-29]。如果樣本的菌群組成越相似，則它們在PCA圖中的距離越接近。如圖8所示，PC1與PC2的貢獻率分別為71.97%和22.34%，說明這2個主成分是解釋樣品微生物菌群結(jié)構(gòu)差異的主要因素。FF1與FF2很靠近，EP1與EP2彼此之間距離較大并且與FF1、FF2也分隔開，說明加工后的老香黃細菌的菌群結(jié)構(gòu)與鮮果相差較大，而老香黃因加工批次和貯藏年限的不同會導(dǎo)致其中的細菌菌群結(jié)構(gòu)也有所差異。

圖8 菌群的主成分分析Fig.8 Principal component analysis

3 結(jié)論

本研究采用純培養(yǎng)方法和基于16S rRNA基因的高通量測序技術(shù)對佛手鮮果與佛手加工品老香黃中的微生物進行分析。根據(jù)高通量測序結(jié)果，佛手鮮果在經(jīng)過了鹽漬、蜜糖漬等一系列的加工工序制作成老香黃的過程中，優(yōu)勢菌群由泛菌屬、腸桿菌屬等變?yōu)镮gnatzschineria、漫游球菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬等。這表明老香黃中可能存在一定的致病菌，但本研究中通過純培養(yǎng)方法并未從老香黃中分離出如高通量測序結(jié)果所示的大部分細菌菌屬，可能是由于在加工成老香黃的過程中，大部分微生物已死亡。另外，高通量測序顯示老香黃中還存在雙歧桿菌屬和乳桿菌屬，這2個菌屬為益生菌，具有改善腸道功能、維持腸道內(nèi)正常菌群平衡等多種作用，但本研究中并未分離出活菌，后續(xù)還有待于增菌并進一步的分離和研究。結(jié)合純培養(yǎng)和高通量測序結(jié)果，雖然以純培養(yǎng)方法未從老香黃中分離出有害微生物，但是老香黃作為藥食兩用食品，其生產(chǎn)和食用的微生物安全依然需要人們的重視。