促紅細胞生成素衍生物螺旋B表面肽對表柔比星所致大鼠心肌損傷的影響

于秀燕 李躍榮 趙冬冬 刁樹玲 李花 郭紀(jì)偉 馬寶新

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1心內(nèi)科，山東 濱州 256600；2腫瘤科；3濱州醫(yī)學(xué)院腫瘤研究實驗室)

表柔比星(EPI)是蒽環(huán)類化療藥物新的衍生物，在臨床上主要用于治療急性白血病、惡性淋巴瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤。但蒽環(huán)類藥物化療的心臟毒性是累積性的，從而限制了許多晚期疾病患者的治療選擇〔1〕。促紅細胞生成素(EPO)是一種糖蛋白，主要由成年腎臟產(chǎn)生。EPO已經(jīng)被證明具有許多非造血功能，包括減少細胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，促進血管生成，加速組織功能恢復(fù)等。然而，EPO會引起一系列不良反應(yīng)，如增加血液黏度、升高血壓和引起血栓形成等，嚴(yán)重限制了其在臨床中的應(yīng)用。EPO衍生物螺旋B表面肽(HBSP)，它不具有EPO的促紅細胞生成素效應(yīng)，避免了上述副作用，但具有與EPO相當(dāng)?shù)男呐K保護作用〔2，3〕。本研究通過建立EPI心肌損傷模型大鼠，并給予EPO及其衍生物HBSP進行治療，驗證EPO及HBSP對EPI誘發(fā)的心肌損傷的保護作用。

1 材料和方法

1.1試劑 EPI購自海正輝瑞制藥有限公司；重組人促紅細胞生成素(rhEPO)購自昂德生物藥業(yè)有限公司；HBSP(純度>98%)購自上海科肽生物科技有限公司；大鼠心肌肌鈣蛋白(cTn)I試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Casepase-3和Bcl-xl抗體及羊抗兔多克隆二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；山羊血清購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2動物分組及造模 健康Wistar大鼠40只，體重(280±20)g，雄性，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，隨機分為四組。對照(CON)組、EPI處理(EPI)組：給予腹腔注射EPI 2.5 mg/kg，每周1次，共6 w，累積劑量15 mg/kg；EPI+EPO組：腹腔注射rhEPO 5 000 IU/kg，每周3次，分別為EPI給藥前1 d，給藥后第1天及給藥后第3天，共6 w；EPI+HBSP組：腹腔注射HBSP 60 μg/kg，給藥時間同EPO組。余均予以等量生理鹽水腹腔注射6 w，每組10只。于第11周處死大鼠。

1.3血細胞計數(shù) 大鼠處死前采集內(nèi)眥靜脈血進行血涂片，瑞氏-吉姆薩染色，待干后即可鏡檢，采用中性樹膠固定。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 于第11周在大鼠內(nèi)眥靜脈采血2 ml，3 000 r/min，離心5 min，分離出血清，取上清液保存于-80℃冰箱，使用ELISA試劑盒檢測血清中cTnI水平。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠后，經(jīng)心臟左心室處插管灌注磷酸鹽緩沖液(PBS)和4%多聚甲醛，固定取心尖組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液浸泡固定24 h，制成蠟塊，切片行HE染色，厚約4 μm。經(jīng)脫蠟、水化、封片等HE染色操作后，通過光學(xué)顯微鏡觀察心臟組織病變。

1.6免疫組化測定 心肌組織經(jīng)過4%多聚甲醛液固定、包埋、切片、脫蠟、乙醇脫水后，微波修復(fù)抗原，冷至室溫，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗，血清封閉后滴加一抗，Caspase-3、Bcl-xl濃度分別為1∶100、1∶200，放置4℃過夜，加二抗，滴加二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。置于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察左心室心肌組織，并用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測定心肌組織中Caspase-3和Bcl-xl蛋白表達的平均光密度 (IOD/area)，并進行統(tǒng)計分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組血細胞計數(shù)比較 與CON組比較，EPI組大鼠紅細胞、白細胞及血小板計數(shù)明顯減少(P<0.05)，與EPI組比較，EPI+EPO組大鼠紅細胞計數(shù)明顯增多(P<0.05)，白細胞及血小板計數(shù)無明顯變化(P>0.05)，EPI+HBSP組大鼠紅細胞、白細胞及血小板計數(shù)均無明顯變化(P>0.05)。見表1。

2.2各組血清cTnI水平比較 與CON組cTnI水平〔(659.57±28.28)pg/ml〕比較，EPI組大鼠血清中cTnI水平增加〔(1263.22±20.70)pg/ml,P<0.05〕。與EPI組比較，EPI+EPO組〔(884.83±23.65)pg/ml〕和EPI+HBSP組〔(755.55±20.67)pg/ml〕血清中cTnI水平下降，尤以EPI+HBSP組效果明顯(P<0.05)。

表1 各組大鼠血細胞計數(shù)比較

與CON組比較：1)P<0.05；與EPI組比較：2)P<0.05，下表同

2.3各組心肌組織病理學(xué)檢測 與CON組比較，EPI組可見部分心肌細胞水腫、呈空泡樣變性，心肌纖維斷裂，排列紊亂，呈灶狀或片狀壞死；心肌細胞間隙明顯增寬，間質(zhì)中可見炎性細胞浸潤。與EPI組比較，EPI+EPO組及EPI+HBSP組上述形態(tài)學(xué)改變明顯較輕，炎性細胞浸潤有一定程度改善。EPI+EPO組與EPI+HBSP組差異不明顯。見圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色(×200)

2.4各組心肌組織Caspase-3和Bcl-xl表達 Caspase-3及Bcl-xl蛋白陽性表達主要位于胞質(zhì)，也有部分在胞質(zhì)和胞核均著色，呈棕黃色。與CON組比較，EPI組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Bcl-xl蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與EPI組比較，EPI+EPO組及EPI+HBSP組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bcl-xl蛋白表達顯著升高(P<0.05)。EPI+EPO組與EPI+HBSP組之間的差異不明顯(P>0.05)。見圖2、圖3，表2。

圖2 各組心肌組織Caspase-3蛋白表達(DAB，×200)

圖3 各組心肌組織Bcl-xl蛋白表達(DAB，×200)

表2 各組心肌組織Caspase-3、Bcl-xl蛋白表達

3 討 論

蒽環(huán)類是一種高效的化療藥物，在臨床上主要用于治療各種惡性腫瘤，但其心臟毒性是蒽環(huán)類藥物治療的一個公認(rèn)的副作用〔1〕。急性毒性發(fā)生在治療過程中或治療后數(shù)天內(nèi)，主要為心電圖的改變。慢性毒性發(fā)生在治療后數(shù)周至數(shù)年，多出現(xiàn)不可逆性改變，包括心肌病和充血性心力衰竭。遲發(fā)性心臟毒性反應(yīng)甚至可能出現(xiàn)于化療后多年之后，即使以低劑量給藥，據(jù)報道這些藥物也會引起進行性心臟功能障礙〔4～6〕。柔紅霉素、多柔比星(阿霉素)是兩種早期的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物。EPI作為蒽環(huán)類藥物新的衍生物，并未表現(xiàn)出較強的治療效果和較低的心臟毒性〔7，8〕。這不但限制了在臨床中的應(yīng)用，影響了治療效果，而且明顯影響了腫瘤患者的生活質(zhì)量。

EPO是具有多效性的細胞因子，被廣泛用于治療腫瘤患者化療藥物誘發(fā)的貧血。研究顯示EPO可通過標(biāo)準(zhǔn)EPO受體降低腫瘤患者生存率〔9，10〕。然而，EPO會引起血液黏度增加、血壓升高和引起血栓形成等一系列副作用，嚴(yán)重限制了其在臨床中的應(yīng)用。HBSP既保留了EPO的組織保護活性又避免了EPO的副作用。本研究通過建立EPI致心肌損傷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)EPI給藥后大鼠出現(xiàn)骨髓抑制，表現(xiàn)為紅細胞、白細胞、血小板三系降低，可以延續(xù)至停藥后。EPO可明顯促進EPI心肌損傷大鼠的紅系造血功能的恢復(fù)，這可能與EPO促進造血細胞增殖分化的作用有關(guān)，而HBSP無刺激造血作用。cTnI在反映心肌損傷方面具有較高的靈敏度及特異性，EPI給藥后大鼠心肌組織中cTnI明顯升高，給予EPO及HBSP干預(yù)后，大鼠心肌組織中cTnI明顯降低，表明EPO及HBSP可明顯減輕心肌損傷。

Caspase-3、Bcl-xl是與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白，其中是Caspase-3細胞凋亡信號通路中的關(guān)鍵蛋白酶，在細胞凋亡中起著中心環(huán)節(jié)的作用，是細胞凋亡的執(zhí)行者〔11，12〕。Bcl-xl是Bcl基因家族成員之一，作用機制可能是通過阻止線粒體釋放細胞色素C起到抑制細胞凋亡的作用，從而阻斷上游Caspase蛋白酶的激活，抑制細胞凋亡〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)EPI組大鼠心肌組織中促凋亡蛋白Caspase-3 的表達明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達明顯下降。給予EPO及HBSP干預(yù)后，大鼠心肌組織中促凋亡蛋白Caspase-3的蛋白表達明顯下降，抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達明顯升高。

綜上所述，EPO及HBSP通過凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bcl-xl的表達發(fā)揮抗凋亡作用，減輕心肌損傷，改善心功能，從而發(fā)揮心臟保護作用。但本研究未能闡明HBSP下調(diào)Caspase-3、上調(diào)Bcl-xl蛋白表達的具體信號通路途徑及作用的受體位點，有望進一步的深入研究。