健脾化濕顆粒對腹瀉型IBS模型大鼠結(jié)腸AQP3、AQP4的影響

呂英超，吳范武，張曉峰，王迎寒△

（1河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德；2唐山華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 唐山）

0 引言

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)屬于慢性功能性胃腸病，其在臨床中較為常見，主要以腹部不適和腹痛并且多伴有排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣?，又是一種缺少形態(tài)學(xué)、生化異常改變的癥候群，并伴有緊張、焦慮等精神癥狀[1,2]。腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant IBS，D-IBS)發(fā)病率較高，約占IBS的40.83%[3]。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是生物膜上的一類特異性膜蛋白，廣泛分布于身體各部位，與水的跨膜轉(zhuǎn)運有著密切聯(lián)系[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，D-IBS患者及動物模型的結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞AQPs表達(dá)有明顯改變[5]。其中研究發(fā)現(xiàn)AQP3即參與結(jié)腸黏膜處水液的轉(zhuǎn)運，也影響其黏膜下層等處的水液轉(zhuǎn)運，AQP3表達(dá)降低后影響了結(jié)腸內(nèi)水液轉(zhuǎn)運，可能導(dǎo)致D-IBS模型大鼠出現(xiàn)腹瀉的癥狀[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，AQP4表達(dá)水平的高低也可以影響結(jié)腸水液吸收，是腹瀉癥狀發(fā)生的重要因素[6,7]，所以本課題通過對D-IBS大鼠模型采取灌服番瀉葉聯(lián)合束縛應(yīng)激的方法進(jìn)行復(fù)制，同時使用健脾化濕顆粒進(jìn)行干預(yù)，以檢測大鼠結(jié)腸黏膜水通道蛋白3、水通道蛋白4的表達(dá)，以此來闡明該顆粒的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

選取的實驗動物為SD雄性大鼠，共60只，級別為SPF級，體重(250±20)g，購自北京維通利華生實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京)2012-0001。在進(jìn)行實驗前的1周先對大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，使其在承德醫(yī)學(xué)院屏障環(huán)境動物實驗室中進(jìn)行飼養(yǎng)，使其能夠適應(yīng)這種環(huán)境。本動物實驗經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行，批準(zhǔn)編號CDMULAC-2014-003。

1.2 藥物及試劑

番瀉葉(安國市昌達(dá)藥業(yè)有限公司，批號1305001)，由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所植化室趙春穎教授鑒定為豆科植物狹葉番瀉Cassiaangustifolia的干燥小葉。匹維溴銨(得舒特，法國蘇威特藥品公司，批號635375);健脾化濕顆粒，該顆粒的藥物有炙黃芪、益智仁、炒白術(shù)、茯苓、砂仁、烏藥、陳皮、炒白芍、防風(fēng)、炙甘草，按照一定的比例進(jìn)行配伍，并使用低溫動態(tài)的方法進(jìn)行提取，并采取冰凍濃縮、噴霧干燥的方法進(jìn)行制備，最后以干法制粒而制成，是由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供；AQP3抗體，AQP4抗體，羊抗兔IgG，山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)/辣根過氧化物酶(HRP)二抗，兔抗β-肌動蛋白(β-actin)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號分別是bs-1253R，bs-10713R，bs-0061R，bs-0295G-HRP，bs-0061R)；sp rabbit HRP kit(DBA試劑盒)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號 54140)。

1.3 儀器

BX53型顯微醫(yī)學(xué)影像工作站(日本奧林巴斯有限公司)；Sceintz-48型高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份公司)；Velocity18r型臺式高速冷凍離心機(jī)(澳大利亞Dynamica公司)；KD-2258型組織切片機(jī)，KD-P 型攤片機(jī)，KD-BMⅢ型生物組織冷凍包埋機(jī)，KD-TS3A型自動組織脫水機(jī)(浙江省金華科迪儀器設(shè)備有限公司)；GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博遠(yuǎn)實業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 藥物的配制

2.1.1 番瀉葉的水浸液

摘撿干凈的番瀉葉，將其放于沸水中進(jìn)行浸泡，時間為30min，并使用雙層的紗布進(jìn)行過濾，將藥渣再次放入沸水中浸泡，時間為20min，再使用雙層的紗布進(jìn)行過濾，之后將濾液合并進(jìn)行減壓濃縮，制得生藥0.3g·ml-1的藥液，將其放于溫度為4℃環(huán)境中進(jìn)行保存。

2.1.2 健脾化濕顆粒

使用0.9%的生理鹽水將健脾化濕顆粒進(jìn)行溶解，分別按照藥物的濃度配成0.625、1.25、2.5g·ml-1的藥液，放于溫度為4℃環(huán)境下進(jìn)行保存。

2.1.3 陽性藥

使用0.9%的生理鹽水對碾碎后的匹維溴銨藥片進(jìn)行溶解，將其制成3g·L-1的混懸藥液，放于溫度為4℃的環(huán)境下進(jìn)行保存，注意在使用之前應(yīng)進(jìn)行搖勻。

2.2 D-IBS大鼠模型的復(fù)制

藥物干預(yù)60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、匹維溴銨藥組、健脾化濕顆粒低、中、高劑量組，共6組，每組10只。將大鼠進(jìn)行1周的飼養(yǎng)使其適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行模型的復(fù)制：所有大鼠在進(jìn)行實驗之前均禁食12h，飲水可自由，正常組的大鼠不用番瀉葉灌胃，其余各組大鼠分別給番瀉葉水浸液(3g·kg-1)灌胃，次/d，連續(xù)灌胃14d。14d后對大鼠灌胃完成后將前上肢使用透明的膠帶進(jìn)行束縛，胸部和肩部時間為1h，次/d，持續(xù)進(jìn)行14d；正常組的大鼠在整個過程中只使用生理鹽水灌胃，劑量均為10ml·kg-1，且該組的大鼠每天只進(jìn)行生理鹽水灌胃處理；模型組的大鼠是在進(jìn)行束縛完成后給予生理鹽水進(jìn)行灌胃；匹維溴銨組大鼠是在束縛完成后給予匹維溴銨(0.03g·kg-1)灌胃；低、中、高劑量組的大鼠在束縛完成后分別給低、中、高劑量的健脾化濕顆粒藥液灌胃，劑量分別為6.25、12.5、25g·kg-1，在使用過程中的劑量與成人的劑量是等效的。

2.3 取材與處理

藥物干預(yù)14d，最后1次給藥后禁食12h，立即處死大鼠，取若干小段的結(jié)腸組織。在每組中抽取6只大鼠的一段結(jié)腸組織，并使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定后做脫水、石蠟包埋、切片處理，用作免疫組織化學(xué)染色檢測AQP3和AQP4表達(dá)。

2.4 各組大鼠在結(jié)腸中AQP3和AQP4的表達(dá)

使用的檢測方法為免疫組織化學(xué)法。對結(jié)腸組織進(jìn)行切片，常規(guī)方法脫蠟至水，在溫度為95℃-98℃下進(jìn)行抗原修復(fù)，時間為30min，先在37℃山羊血清中進(jìn)行封閉處理，時間為30min，之后進(jìn)行一抗在溫度為4℃的環(huán)境下進(jìn)行孵育(一抗1:200，PBS作為陰性對照)過夜，二抗在37℃環(huán)境下進(jìn)行孵育，時間為2h，DAB顯色，在鏡下進(jìn)行觀察并控制好顯色時間。當(dāng)胞漿中出現(xiàn)棕黃色的反應(yīng)物時則表明出現(xiàn)了陽性反應(yīng)，顏色越深則說明出現(xiàn)的陽性反應(yīng)越大；若沒有出現(xiàn)棕黃色的反應(yīng)物則說明為陰性。隨機(jī)選取每張片子6個不相互重疊的×400視野進(jìn)行拍照，用Image-pro plus(IPP)圖像分析軟件，對照片進(jìn)行半定量分析并計算積分吸光度IA，其均值作為該大鼠AQP3和AQP4表達(dá)的數(shù)值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料使用s表示，并進(jìn)行t檢驗，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義則使用P＜0.05表示。

3 結(jié)果

在各組結(jié)腸中AQP3和AQP4的表達(dá)變化：與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸中AQP3和AQP4表達(dá)顯著下降(P＜0.01)。與模型組比較，低、中、高劑量組及匹維溴銨組大鼠結(jié)腸中AQP3和AQP4表達(dá)顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)。與匹維溴銨組比較，中劑量組和高劑量組大鼠結(jié)腸中AQP3和AQP4表達(dá)顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表1 健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸中AQP3和AQP4表達(dá)的影響，n=3）

表1 健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸中AQP3和AQP4表達(dá)的影響，n=3）

組別 劑量/g·kg-1 AQP3 AQP4正常對照組 - 0.4067±0.0068 0.4596±0.0072模型組 - 0.1851±0.0035 0.1702±0.0099匹維溴銨組 0.03 0.3042±0.0064 0.2876±0.0156低劑量組 6.25 0.3548±0.0066 0.2669±0.0071中劑量組 12.5 0.3972±0.0109 0.3145±0.0119高劑量組 25 0.4388±0.0063 0.3934±0.0131

4 討論

健脾化濕顆粒源于臨床驗方，方內(nèi)含痛瀉要方的成分，意在調(diào)和肝脾，補脾柔肝，健脾胃理順氣，能夠祛濕止瀉。其主要是用來治療脾虛濕盛肝旺之泄瀉，對于腹瀉型腸易激綜合征有很好的療效。本實驗所采用的D-IBS大鼠模型是通過灌服番瀉葉聯(lián)合束縛應(yīng)激法建立[8]，中醫(yī)學(xué)中此模型屬于脾虛肝郁證型，即脾虛在前、肝郁在后、土虛木乘從而形成脾虛肝郁證；治療原則是健脾益氣為主，理氣疏肝為輔[9]。

前期研究證實[9-12]，本方對脾虛型腸易激綜合征模型大鼠稀便級異常、內(nèi)臟高敏感有很好的治療作用，能明顯改善模型大鼠結(jié)腸組織中NO、NOS、CGRP的水平及5-HT、CRF及其受體的表達(dá)量。本實驗主要采用免疫組化的方法檢測AQP3、AQP4蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組AQP3、AQP4表達(dá)顯著降低，說明兩者在D-IBS腹瀉發(fā)病過程中起重要作用;經(jīng)健脾化濕顆粒治療后，AQP3、AQP4的表達(dá)顯著升高，提示健脾化濕顆粒通過升高模型大鼠結(jié)腸部位AQP3和AQP4表達(dá)，提高結(jié)腸水液吸收能力從而改善D-IBS腹瀉癥狀，說明這可能是健脾化濕顆粒治療D-IBS腹瀉癥狀的作用機(jī)制之一。