SIRT1對大鼠血管平滑肌細胞衰老的影響

李書國， 童 格，葉 明，鄧娟娟，邵 文

1)三峽大學老年醫(yī)學研究所 湖北宜昌 443003 2)宜昌市中心人民醫(yī)院老年病科 湖北宜昌 443003

血管平滑肌細胞衰老與多種心血管系統疾病的發(fā)生有關，動脈粥樣硬化、腦卒中等疾病發(fā)生時均伴隨有血管平滑肌細胞衰老[1]。血管平滑肌細胞分布于動脈中層，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)能夠誘導血管平滑肌細胞衰老，導致血管組織功能障礙[2]。沉默信息調節(jié)因子1(silence information regulator 1,SIRT1)是Sirtuin蛋白家族的成員之一，具有調控細胞代謝、抵抗應激、調控胚胎發(fā)育等多種作用，在成人及胚胎組織中廣泛表達[3]。研究[4-6]顯示，SIRT1具有抵抗衰老相關疾病的作用，在神經退行性疾病、心血管系統疾病中發(fā)揮保護作用；SIRT1能夠抑制內皮細胞衰老。本實驗采用Ang Ⅱ誘導血管平滑肌細胞衰老，探討SIRT1過表達對血管平滑肌細胞衰老的影響，為明確SIRT1在動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞衰老中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑6周齡SD雄性大鼠25只，體重150～180 g，購自三峽大學實驗動物中心。β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司，P21抗體購自美國Santa Cruz公司,Ang Ⅱ購自美國Millipore公司，P53抗體購自美國Abcam公司，HRP標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，SIRT1抗體購自上海士鋒生物科技有限公司，PI細胞周期檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，PCR試劑購自美國Invitrogen公司；SIRT1過表達慢病毒載體(Lv-SIRT1)和陰性對照慢病毒載體(Lv-NC)由上海銳賽生物技術有限公司構建。

1.2血管平滑肌細胞的分離培養(yǎng)[7]SD雄性大鼠斷頸處死，取胸腹主動脈，剔除脂肪及血管外膜后剪碎，轉移至細胞培養(yǎng)瓶內，加入含有體積分數20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37 ℃、體積分數5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，5 d后去除組織塊，加含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。取第3代細胞進行以下實驗。

1.3細胞分組與轉染取對數生長期細胞分為對照組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Lv-NC組、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1組，每組3個復孔。Ang Ⅱ+Lv-NC組、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1組細胞分別轉染陰性對照慢病毒載體和SIRT1過表達慢病毒載體；Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Lv-NC組、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1組給予100 nmoL/L的Ang Ⅱ培養(yǎng)液培養(yǎng)，誘導細胞衰老；按照常規(guī)方法進行慢病毒轉染，MOI=30，轉染后3 d觀察其轉染效率高于90%。設置僅用培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞為對照。

1.4qRT-PCR檢測SIRT1mRNA表達水平取各組細胞培養(yǎng)2 d后，加入Trizol提取細胞中的總RNA，步驟同試劑盒說明書。DEPC水溶解RNA。用cDNA合成試劑盒進行反轉錄。以SYBR進行qRT-PCR。引物序列：SIRT1上游5’-CGGCTGCCA CAGCGTCAT-3’，下游5’-ACAATCTGCCACAGGGT CAT-3’；GAPDH上游5’-ACAACTTTGGCATTGTG GAA-3’，下游5’- GATGCAGGGATGATGTTCTG-3’。反應條件：94 ℃，10 min；94 ℃，20 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s，共40個循環(huán)，根據目的基因的Ct值，用公式2-ΔΔCt計算SIRT1表達水平。

1.5Western blot法檢測SIRT1蛋白表達水平取各組細胞培養(yǎng)2 d后，添加150 μL的RIPA裂解液，置冰上裂解15 min。4 ℃高速離心，吸取上清，用BCA法定量。配制100 g/L的分離膠和50 g/L的濃縮膠。每個上樣孔中添加40 μg蛋白樣品，80 V電壓電泳30 min，蛋白電泳至分離膠和濃縮膠的分界處，調整電壓到120 V，蛋白電泳至距離底部邊緣約1 cm時，停止電泳。將PVDF膜裁剪成凝膠大小，浸泡于轉移緩沖液中30 min，300 mA的電流轉膜50 min。PVDF膜經過50 g/L脫脂奶粉封閉以后，浸泡于1∶1 000稀釋的一抗和1∶4 000稀釋的二抗中進行結合反應，ECL發(fā)光，Image J掃描。GAPDH作為內參，以SIRT1與內參條帶灰度值的比值作為SIRT1蛋白的表達水平。

1.6β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老取各組細胞培養(yǎng)2 d，PBS洗滌，每孔加1 mL固定液，室溫下固定10 min，PBS洗滌，添加β-半乳糖苷酶染色液，以膜封板后，37 ℃孵育過夜。顯微鏡下觀察，藍色細胞為陽性細胞，計算陽性細胞占總細胞數目的百分比。

1.7Western blot法檢測細胞中P21、P53蛋白的表達取各組細胞培養(yǎng)2 d后，采用Western blot法檢測細胞中P21、P53蛋白水平，步驟同1.5。

1.8PI單染法檢測細胞周期取各組細胞培養(yǎng)2 d后，添加體積分數70%的乙醇溶液，4 ℃過夜。離心后，收集細胞，添加含有50 mg/L PI的PBS溶液500 μL，4 ℃反應30 min。上流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.9統計學處理采用SPSS 21.0分析，各組血管平滑肌細胞中SIRT1的表達、β-半乳糖苷酶陽性率、P21、P53蛋白表達和細胞周期分布的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組血管平滑肌細胞中SIRT1表達的比較見表1。

表1 各組血管平滑肌細胞中SIRT1表達的比較(n=3)

2.2各組血管平滑肌細胞中β-半乳糖苷酶陽性率和P21、P53蛋白表達水平比較見表2和圖1。

表2 各組血管平滑肌細胞中β-半乳糖苷酶陽性率和P21、P53蛋白表達水平比較(n=3)

1～4：分別為對照組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Lv-NC組、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1組

2.3各組血管平滑肌細胞周期分布比較見表3。

表3 各組血管平滑肌細胞周期分布比較(n=3) %

3 討論

動脈粥樣硬化是多種心血管系統疾病發(fā)生的基礎，而血管平滑肌細胞衰老是動脈粥樣硬化發(fā)生的早期標志[8]。血管平滑肌細胞在動脈粥樣硬化發(fā)生時遷移至內膜，并在壞死泡沫細胞周圍聚集，形成纖維帽，進而誘發(fā)動脈粥樣硬化斑塊的產生[9-10]。Ang Ⅱ是動脈粥樣硬化發(fā)生的誘導因子，可以誘導血管平滑肌細胞衰老[11-12]。本研究結果顯示，Ang Ⅱ處理后的血管平滑肌細胞β-半乳糖苷酶陽性率升高，提示成功構建了血管平滑肌細胞體外衰老模型。

SIRT1是存在于哺乳動物體內的與Sir2同源的保守蛋白，在人體骨骼肌、腦、心臟等組織中的表達水平最高，在胰腺、卵巢、腎臟等組織中也有不同程度的表達[13-14]。SIRT1具有抵抗氧化應激、減少細胞凋亡等多種作用，其在動脈粥樣硬化組織中表達下調；SIRT1表達水平與總膽固醇、低密度脂蛋白水平呈負相關[15-16]。在肝癌細胞、血管內皮細胞、胰島β細胞等多種細胞中SIRT1與細胞能量代謝和壽命有關[17-19]。本實驗結果顯示，SIRT1過表達可以抑制Ang Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞衰老，提示SIRT1在動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞衰老中發(fā)揮抑制作用。

P21、P53是細胞衰老的標志蛋白[20]。有研究[21]表明，SIRT1具有去乙?；疨53蛋白的第382個賴氨酸殘基的作用，SIRT1可能通過抑制P53蛋白的表達抑制下游靶基因的轉錄和激活。P21是P53的下游靶基因，細胞內P53表達下調可以抑制P21的表達。P21還是一種細胞周期抑制因子，可以抑制細胞周期蛋白E活性，使細胞周期停滯在G1期，而細胞G1期向S期轉變是細胞衰老的特征之一[22]。本實驗的結果顯示，衰老誘導后的血管平滑肌細胞中P21、P53蛋白表達水平升高，G0/G1期細胞比例升高；SIRT1過表達細胞中P21、P53蛋白表達水平降低，G0/G1期細胞比例降低。以上結果提示SIRT1可能通過降低P53、P21蛋白表達減輕Ang Ⅱ對血管平滑肌細胞周期的阻滯作用。

總之，SIRT1參與動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞衰老的發(fā)生，SIRT1過表達能夠抑制Ang Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞衰老，可能與細胞中P53和P21表達下調，促進細胞從G1期向S期轉變有關。本實驗結果為研究SIRT1調控動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞衰老機制奠定了基礎，為研究動脈粥樣硬化分子發(fā)病機制提供了參考。