超聲波輔助酶法提取花生紅衣中白藜蘆醇的工藝優(yōu)化

黃兆翔，龐道睿，王衛(wèi)飛，鄒宇曉，廖森泰

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)與農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣州 510610； 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣州 510225)

白藜蘆醇(Resveratrol)的化學(xué)名稱為3,5,4′-三羥基芪(3,5,4′-trihydroxystilbene)，是一種非黃酮類多酚化合物,已知其天然植物來源包括葡萄、日本虎杖、桑果和花生等[1]。白藜蘆醇通常與葡萄糖結(jié)合以糖苷的形式存在，少量以游離態(tài)的形式存在植物中[2]。白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，具有降低血脂、抗病毒、抗腫瘤等生物活性[3-4]。近年來，市場上出現(xiàn)了以白藜蘆醇為活性成分的保健品[3]。

花生是我國重要的油料作物，花生紅衣是花生油提取工藝中主要的副產(chǎn)物之一，每年產(chǎn)量約600 t[5]?；ㄉt衣中含有白藜蘆醇、原花色素等天然多酚類物質(zhì)[6]。然而在花生油生產(chǎn)行業(yè)中，花生紅衣作為一種經(jīng)濟效益很低的副產(chǎn)品一直未得到充分利用。Sanders等[7]報道了成熟可食用花生種子中白藜蘆醇含量僅為0.03～0.14 μg/g，而在花生紅衣中白藜蘆醇含量為0.65 μg/g。由此可見，從花生紅衣中提取高附加值的白藜蘆醇是提高花生產(chǎn)業(yè)綜合效益的一種有效途徑。

花生紅衣中白藜蘆醇提取應(yīng)用較多的是傳統(tǒng)的固液萃取技術(shù)[8-10],其能耗高、時間長，存在多酚類物質(zhì)受熱降解的風(fēng)險[11]。目前已有將超聲波用于花生根中白黎蘆醇的提取中[12],同時酶法作為酚類物質(zhì)提取的一種方法，具有產(chǎn)物回收率高、溶劑用量少等優(yōu)點[13]。若將二者結(jié)合使用，超聲波能更好地促進物料破碎，增大固相和液相之間的表面接觸面積[14]，同時酶可破壞細(xì)胞壁，減少傳質(zhì)阻力[15]，從而有利于目標(biāo)物的提取。目前，F(xiàn)ang等[16]發(fā)現(xiàn)超聲波輔助酶法提取旱蓮草(EcliptaprostrateL.)多酚物質(zhì)時，總酚含量較有機溶劑提取法提高1.63倍；Ran等[17]提取蘋果皮多酚時也得出相似結(jié)論。然而關(guān)于超聲波輔助酶法提取花生紅衣中白藜蘆醇的報道相對較少。

本研究采用超聲波輔助酶法提取花生紅衣中的白藜蘆醇，通過單因素實驗優(yōu)化了工藝參數(shù)，為花生紅衣資源高值化利用技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

花生紅衣,廣州市至潤油脂食品工業(yè)有限公司；無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈(色譜純)，Thermo fisher控制設(shè)備國際有限公司；纖維素酶(400 U/mg)、β-葡萄糖苷酶(10 U/mg)、半纖維素酶(2 U/mg)、木聚糖酶(6 000 U/mg)，上海瑞永生物科技有限公司；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)，四川省維克奇生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity II高效液相色譜儀，美國Agilent科技有限公司；SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；CR22G-Ⅲ型高速冷凍離心機，株式會社日立制作所；N-110回旋蒸發(fā)器，上海愛朗儀器有限公司；OSB-2100水浴鍋，上海愛朗儀器有限公司；CS-2000型高速多功能粉碎機，永康市天祺盛世工茂有限公司；FE20實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白藜蘆醇的提取

白藜蘆醇的提取參考Puri等[12]方法，稍作變動。將花生紅衣樣品進行粉碎，過40目篩，4℃保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取5 g花生紅衣粉置于250 mL三角瓶，加入10 mL水，調(diào)節(jié)pH為5.0，按花生紅衣與各類酶質(zhì)量比為50∶1分別添加纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶于三角瓶中，酶解90 min(酶解溫度與超聲溫度相同)。酶解完成后按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇進行超聲提取，經(jīng)離心后取上層清液減壓濃縮，乙醇定容作為樣液。

1.2.2 白藜蘆醇HPLC定量分析

色譜條件參考Sun等[18]的方法，稍作變動。色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相采用經(jīng)0.45 μm濾膜過濾的乙腈-水溶液(體積比35∶65)，柱溫25℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL，經(jīng)RP-HPLC分離后，在波長303 nm下通過紫外檢測器對白藜蘆醇定量分析，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5繪圖軟件繪制單因素實驗圖，以SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件分析樣品差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇的HPLC定量

花生紅衣粗提液中白藜蘆醇HPLC色譜圖如圖1所示。

圖1 花生紅衣粗提液中白藜蘆醇HPLC色譜圖

由圖1可知，樣品粗提液在5.872 min處有一白藜蘆醇吸收峰。回歸方程為Y=67.254X-33.037，R2=0.999 3，式中Y為白藜蘆醇的峰面積，X為白藜蘆醇的質(zhì)量濃度。實驗結(jié)果表明，白藜蘆醇在6～60 μg/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。

2.2 白藜蘆醇提取工藝的單因素實驗

2.2.1 酶種類對白藜蘆醇提取的影響

稱取4份質(zhì)量約為5.0 g的花生紅衣樣品置于錐形瓶中，分別添加100 mg纖維素酶、半纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比1∶20，超聲溫度50℃，超聲時間30 min，其他操作同1.2.1?？疾烀阜N類對白藜蘆醇提取的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶種類對白藜蘆醇提取的影響

由圖2可知，半纖維素酶、β-葡萄糖苷酶對白藜蘆醇的提取量顯著高于纖維素酶、木聚糖酶(p<0.05)。半纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶處理花生紅衣后白藜蘆醇提取量分別為(0.71±0.02)、(0.65±0.02)、(0.53±0.02)、(0.55±0.01) mg/100 g。Lin等[19]采用Pectinex?糖苷酶提取虎杖白藜蘆醇時發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶與Pectine?糖苷酶都可催化去糖基化，同時植物中的白藜蘆醇常與葡萄糖結(jié)合以糖苷的形式存在，即白藜蘆醇苷[2]。β-葡萄糖苷酶作用于花生紅衣中的白藜蘆醇苷導(dǎo)致糖苷鍵斷裂，釋放出更多白藜蘆醇。半纖維素酶相比纖維素酶具有良好的親水性，更好地削弱半纖維素、纖維素網(wǎng)絡(luò)，釋放更多多酚物質(zhì)[20-21]。因此，選擇半纖維素酶進行實驗。

2.2.2 溶劑種類對白藜蘆醇提取的影響

稱取4份質(zhì)量約為5.0 g的花生紅衣樣品置于錐形瓶中，半纖維素酶添加量100 mg，料液比1∶20，分別添加體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮4種溶劑于50℃超聲30 min，其他操作同1.2.1。考察溶劑種類對白藜蘆醇提取的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溶劑種類對白藜蘆醇提取的影響

由圖3可知，不同溶劑對白藜蘆醇提取效果具有顯著性差異(p<0.05)。甲醇作為提取劑時效果最好，白藜蘆醇提取量為(0.74±0.01) mg/100 g；其次為乙醇，白藜蘆醇提取量為(0.58±0.01) mg/100 g，而乙酸乙酯與丙酮的提取效果較差。結(jié)合溶劑相關(guān)成本，同時考慮環(huán)境污染及安全性問題，本實驗選擇乙醇作為提取溶劑。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇提取的影響

稱取5份質(zhì)量約為5.0 g的花生紅衣樣品置于錐形瓶中，每份樣品添加半纖維素酶100 mg，料液比1∶20，超聲溫度50℃，超聲時間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%、90%、100%，其他操作同1.2.1?？疾煲掖俭w積分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇提取的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇提取的影響

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，白藜蘆醇提取量呈先升后降的趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達到80%時，白藜蘆醇提取量達到最大，為(0.87±0.02) mg/100 g；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時，白藜蘆醇提取量下降。分析其原因可能為：在乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，花生紅衣中白藜蘆醇溶解度較低導(dǎo)致無法完全溶出；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達到80%時，白藜蘆醇提取量最大，可能是在一定濃度下溶劑對白藜蘆醇的親和力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增強；乙醇體積分?jǐn)?shù)過高(>80%)時，一些醇溶性雜質(zhì)和親脂性成分溶出，這些成分和白藜蘆醇競爭與乙醇-水分子結(jié)合，使白藜蘆醇提取效率下降[22]。另外，經(jīng)超聲處理的粗提液可能產(chǎn)生自由基，自由基的量與提取液的組成密切相關(guān)，無水乙醇更容易產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致白藜蘆醇損失[23]。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.2.4 料液比對白藜蘆醇提取的影響

稱取4份質(zhì)量約為5.0 g的花生紅衣樣品置于錐形瓶中，每份樣品半纖維素酶添加量100 mg，采用80%乙醇提取，超聲時間30 min，超聲溫度50℃，料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，其他操作同1.2.1。考察料液比對白藜蘆醇提取的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在料液比1∶15～1∶30的范圍內(nèi)，白藜蘆醇提取量呈先升后降的趨勢。當(dāng)料液比為1∶25時，白藜蘆醇提取量最大，為(0.79±0.03) mg/100 g。其原因可能為：一方面，料液比增加可增大花生紅衣與提取溶劑接觸面，多酚更易與細(xì)胞壁的多糖分離；另一方面，在超聲波的作用下，料液比過高引起各實驗組粗提液產(chǎn)生自由基，且可能存在自由基氧化作用引起白藜蘆醇損失，提取率下降[22-23]。因此，選擇1∶25為最佳料液比。

圖5 料液比對白藜蘆醇提取的影響

2.2.5 超聲時間對白藜蘆醇提取的影響

稱取4份質(zhì)量約為5.0 g的花生紅衣樣品置于錐形瓶中，每份樣品添加半纖維素酶100 mg，在料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，50℃下分別提取白藜蘆醇20、30、40、50 min，其他操作同1.2.1?？疾斐晻r間對白藜蘆醇提取的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 超聲時間對白藜蘆醇提取的影響

由圖6可知，在超聲時間20～50 min的范圍內(nèi)，隨著超聲時間的延長白藜蘆醇提取量呈先升后降的趨勢。當(dāng)超聲時間在30 min時白藜蘆醇提取量達到最大，為(0.75±0.01) mg/100 g；繼續(xù)延長超聲時間至40 min時，白藜蘆醇提取量稍微降低，與30 min樣品組無顯著性差異(p>0.05)；此后繼續(xù)延長超聲時間，白藜蘆醇提取量持續(xù)降低。分析原因可能為：在超聲時間20～30 min，由于超聲波在溶液中傳播時產(chǎn)生空化效應(yīng)，空化中微小氣泡的爆裂產(chǎn)生極大的壓力導(dǎo)致細(xì)胞壁迅速破裂，白藜蘆醇不斷地從花生紅衣中被釋放出來[16]；隨著超聲時間的延長，在40～50 min內(nèi)，大部分白藜蘆醇已經(jīng)被提取出來，過長時間的超聲處理具有破壞活性物質(zhì)的作用，白藜蘆醇分子結(jié)構(gòu)被破壞或發(fā)生改變[24]；超聲波在一定條件下可能會增強多酚氧化酶的活性及產(chǎn)生自由基，多酚類物質(zhì)被氧化導(dǎo)致白藜蘆醇提取率降低[25]。因此，選擇超聲時間為30 min。

2.2.6 超聲溫度對白藜蘆醇提取的影響

稱取4份質(zhì)量約為5.0 g的花生紅衣樣品置于錐形瓶中，分別添加100 mg半纖維素酶，超聲溫度分別為30、40、50、60℃，超聲時間30 min，采用80%乙醇作為提取劑，料液比1∶20，其他操作同1.2.1?？疾斐暅囟葘Π邹继J醇提取的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 超聲溫度對白藜蘆醇提取的影響

由圖7可知，隨著超聲溫度升高，白藜蘆醇提取量逐漸增大，且于50℃時達到最大值，為(0.92±0.03)mg/100 g，此后繼續(xù)升高溫度白藜蘆醇提取量反而下降。分析原因可能為：一方面，溫度升高可能會改變物料的物理狀態(tài)，同時降低其吸收強度，使白藜蘆醇更容易被提取出來；但過高的溫度會促進白藜蘆醇氧化分解，破壞其分子結(jié)構(gòu)，對提取效率產(chǎn)生不利的影響[26]；另一方面，酶解溫度與超聲溫度保持一致，因此當(dāng)超聲溫度高于50℃時，即酶解溫度高于50℃，可能存在半纖維素酶活性衰減導(dǎo)致白藜蘆醇難溶出。因此，選擇超聲溫度為50℃。

綜上，超聲波輔助酶法提取花生紅衣中白藜蘆醇的工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶25、超聲時間30 min、超聲溫度50℃、半纖維素酶添加量2%，在此條件下進行了3次平行實驗，得到白藜蘆醇提取量平均值為(0.854±0.025) mg/100 g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%，實驗結(jié)果重現(xiàn)性較好。另外，實驗發(fā)現(xiàn)最優(yōu)條件下白藜蘆醇的提取量不及圖4和圖7單因素實驗的最大值，這是因為花生紅衣中的白藜蘆醇含量很低，極易出現(xiàn)檢測誤差造成的。

3 結(jié) 論

本文通過單因素實驗對超聲波輔助酶法提取花生紅衣中白藜蘆醇的工藝進行優(yōu)化，在酶解pH 5.0、酶添加量2%條件下得出最佳提取工藝條件為：采用半纖維素酶提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶25，超聲溫度50℃，超聲時間30 min。在最佳工藝條件下白藜蘆醇提取量為(0.854±0.025)mg/100 g。后續(xù)還將在實驗中優(yōu)化其他因素如酶添加量、提取pH等。