油橄欖葉提取物的抑菌活性研究

孔維寶，楊樹玲，霍煥燃，景 洋，張愛梅，牛世全

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

油橄欖是世界上著名的木本油料樹種，其葉片提取物富含橄欖苦苷和黃酮等活性成分，且含量明顯高于果實(shí)，具有較強(qiáng)的抑菌活性[1-2]。在地中海地區(qū)，油橄欖葉提取物早已被人們當(dāng)作民間醫(yī)藥來治療發(fā)燒和其他疾病如瘧疾等。橄欖苦苷是一類被歸于裂環(huán)烯醚萜類的苦味單萜類皂苷，毒性極低，是油橄欖葉中最具抗菌活性的物質(zhì)[3]。此外，橄欖苦苷有很強(qiáng)的抗氧化活性，尤其是作為自由基清除劑，能夠提高SOD活性[4]，并具有抗腫瘤、降血糖等藥理作用[5]。

隨著抗生素類和磺胺類等抗菌藥物的大量使用，細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)。因此，研發(fā)高效、廣譜、低殘留、低毒的藥物將成為防治細(xì)菌感染類疾病的重中之重。研究發(fā)現(xiàn)中藥或天然植物提取物可抑制或直接殺滅病原菌而不產(chǎn)生耐藥性[6-7]，因此抗菌中藥逐步成為研究熱點(diǎn)。而橄欖苦苷作為一種裂環(huán)烯醚萜類化合物，對細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制效果。本文以甘肅隴南油橄欖葉提取物(Olive leaves extract，OLE)為試樣，分析其對幾種常見細(xì)菌的抑菌活性，為油橄欖葉提取物制備成抗菌制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油橄欖葉提取物(OLE)：由隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司提供，主要活性成分及含量為橄欖苦苷34.62%、總多酚0.15%、總黃酮10.23%。

大腸桿菌(Escherichiacoli)CVCC1570、抗四環(huán)素大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(S.aureus)CVCC 1882、金黃色葡萄球菌(SH7)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CMCC26069、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)CMCC(B)63302，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；枯草芽孢桿菌(B.subtilis),保藏于西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、BR生化試劑，購自海博生物技術(shù)有限公司。氯化鈉、鹽酸小檗堿、氯化三苯四氮唑(TTC)、二甲基亞砜(DMSO)，分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BT-25S型電子天平，德國賽多利斯；IS-RDV1型恒溫振蕩器，美國Crystal；HFsafe 1500型生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司；WP-RO-10B型實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)，四川沃特爾科技發(fā)展有限公司；TU-1810DPC型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DNP-9052-1A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司；不銹鋼數(shù)顯卡尺，天津市量具廠；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備

10倍稀釋法制備菌懸液：分別吸取稀釋至10-5、10-6、10-7、10-8、10-9倍的菌懸液100 μL于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中涂布，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，對菌落數(shù)在30～300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，求平均值。最終挑選菌液濃度為106～107CFU/mL菌懸液備用。

1.2.2 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)、最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)測定

采用96孔板肉湯稀釋法[8]測定OLE對8種供試菌的MIC和MBC。鹽酸小檗堿作為對照，每孔中加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基100 μL，96孔板的A～D行第1孔中加入100 μL 64 mg/mL的OLE樣品，E～H行第1孔中加入100 μL 64 mg/mL的鹽酸小檗堿樣品，二倍稀釋法使藥液濃度呈梯度遞減，第10孔中取出的藥液與培養(yǎng)基混合液棄去，第11孔為加藥不加菌液的陰性對照，第12孔為加菌液不加藥的空白對照。除第11列和第12列，每孔中加入5 μL菌懸液，置于微型振蕩器上振蕩1 min，使各孔內(nèi)溶液混勻，37℃孵育18 h，以肉眼觀察無渾濁的藥液質(zhì)量濃度即為受試菌的MIC。

另取潔凈微孔板，每孔中加入100 μL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，取各板中肉眼可見渾濁孔的前一澄清孔中培養(yǎng)液5 μL置于該板中培養(yǎng)，每孔3個(gè)重復(fù)，在37℃恒溫箱中孵育18 h后，加入5 g/L氯化三苯四氮唑(TTC)5 μL，35℃孵育2 h后觀察，有細(xì)菌生長呈紅色，繼續(xù)取前一孔培養(yǎng)液進(jìn)行觀察，直至無紅色即為該菌的MBC。

1.2.3 抑菌活性測定

采用牛津杯法[9]評價(jià)OLE對8種供試細(xì)菌的抑菌活性。吸取100 μL菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，靜置30 min后，將平板均分為4個(gè)區(qū)，分別放入5個(gè)牛津杯(裝量250 μL)，每種細(xì)菌重復(fù)3次，靜置15 min后置于37℃培養(yǎng)18 h。觀察并測量各抑菌圈直徑(d)，記錄抑菌圈大小。按照抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)抑菌圈直徑判定細(xì)菌對OLE的敏感度。細(xì)菌對OLE表現(xiàn)出敏感度越高則OLE對該細(xì)菌具有更好的抑菌效果。

1.2.4 OLE對細(xì)菌生長曲線的影響

采用稀釋法[10]分析OLE對8種供試細(xì)菌生長曲線的影響。依次將菌懸液和不同質(zhì)量濃度的OLE溶液加入滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔6 h置于超凈工作臺內(nèi)取樣一次，于540 nm波長處測定其吸光度，繪制細(xì)菌生長曲線。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，用SPSS18.0和Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIC與MBC

采用稀釋法分析OLE對8種供試菌的MIC和MBC，結(jié)果見表1。

表1 OLE與鹽酸小檗堿的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)

由表1可知，OLE與鹽酸小檗堿在測試質(zhì)量濃度下對銅綠假單胞菌無抑制作用。OLE對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)及大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng)，對蠟狀芽孢桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑制作用較弱。OLE對各細(xì)菌的MIC與MBC以及抑菌活性分別為：表皮葡萄球菌(MIC 1 mg/mL，MBC 2 mg/mL)=金黃色葡萄球菌(SH7)(MIC 1 mg/mL，MBC 2 mg/mL)=大腸桿菌(MIC 1 mg/mL，MBC 2 mg/mL)>枯草芽孢桿菌(MIC 2 mg/mL，MBC 4 mg/mL)=金黃色葡萄球菌(MIC 2 mg/mL，MBC 4 mg/mL)>蠟狀芽孢桿菌(MIC 8 mg/mL，MBC 16 mg/mL)=抗四環(huán)素大腸桿菌(MIC 8 mg/mL，MBC 16 mg/mL)。與對照鹽酸小檗堿相比，OLE對枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)的抑菌效果低于鹽酸小檗堿，而對蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于鹽酸小檗堿，對大腸桿菌的抑菌效果與鹽酸小檗堿的相當(dāng)。有研究報(bào)道[8,11]橄欖苦苷對金黃色葡萄球菌的MIC為0.031 2～0.125 mg/mL；橄欖總黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌均有抑制作用，對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC分別為0.25、0.125、0.062 5 mg/mL。以上研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，這可能主要與供試樣品的來源及純度有關(guān)系。

2.2 抑菌活性

OLE對8種細(xì)菌的抑菌圈大小和細(xì)菌的敏感度如表2所示。

表2 OLE對8種細(xì)菌的抑菌圈大小及細(xì)菌敏感度

由表2可知，8種細(xì)菌對空白對照均表現(xiàn)出不敏感或敏感度不明顯，實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)銅綠假單胞菌對OLE表現(xiàn)不敏感或低度敏感，OLE對其他7種細(xì)菌都有抑菌作用。OLE質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，蠟狀芽孢桿菌和銅綠假單胞菌表現(xiàn)為不敏感，其他細(xì)菌均表現(xiàn)為低度敏感。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌分別表現(xiàn)為低度敏感與不敏感，表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)、大腸桿菌及抗四環(huán)素大腸桿菌均表現(xiàn)為中度敏感。OLE質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，大腸桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌處于極度敏感(d=(25.07±3.02)mm，d=(24.89±1.58)mm)，表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)處于極度敏感(d=(20.11±1.02)mm，d=(21.35±2.06)mm，d=(20.01±1.21)mm)，枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌處于中度敏感(d=(11.32±1.32)mm，d=(10.12±1.58)mm)。以上結(jié)果顯示：OLE在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對大腸桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，其次為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)，而枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌對OLE表現(xiàn)出敏感度不高。苯酚類或抗氧化物通過與細(xì)胞的肽聚糖作用來破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或損害細(xì)胞膜，兩者共同作用抑制細(xì)菌的生長[12]。由于橄欖苦苷羥基鄰位二取代結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性強(qiáng)[13]，以及大腸桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)細(xì)胞壁肽聚糖含量低和層次少，橄欖苦苷易于進(jìn)入和產(chǎn)生抑制作用。表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)、枯草芽孢桿菌以及蠟狀芽孢桿菌均為革蘭氏陽性菌，菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密，以及芽孢強(qiáng)抗逆性使得橄欖苦苷對枯草芽孢桿菌以及蠟狀芽孢桿菌的作用較弱。

2.3 OLE對細(xì)菌生長曲線的影響

2.3.1 OLE對芽孢桿菌生長曲線的影響(見圖1)

注：A為蠟狀芽孢桿菌，B為枯草芽孢桿菌。

由圖1(A)可知，在不添加OLE的培養(yǎng)基中，蠟狀芽孢桿菌在培養(yǎng)12 h后細(xì)菌生物量的積累明顯加快，12～30 h為蠟狀芽孢桿菌的對數(shù)生長期。添加OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL溶液的培養(yǎng)基中蠟狀芽孢桿菌在培養(yǎng)18 h后適應(yīng)環(huán)境并快速繁殖，在18～24 h處于對數(shù)生長期，與對照組比較，此時(shí)細(xì)菌的對數(shù)生長期相對延緩，說明OLE對蠟狀芽孢桿菌的生長有一定的抑制作用。當(dāng)添加OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液時(shí)，培養(yǎng)到18 h后蠟狀芽孢桿菌開始迅速增長，在培養(yǎng)18～24 h時(shí)處于對數(shù)生長期，但菌體濃度低于5 mg/mL組，表明蠟狀芽孢桿菌隨著OLE質(zhì)量濃度的增加，對數(shù)生長期被相應(yīng)延緩或推遲。由圖1(B)可知，當(dāng)不添加OLE時(shí)，培養(yǎng)到6 h后枯草芽孢桿菌開始增長，在培養(yǎng)6～30 h時(shí)處于對數(shù)生長期。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，在培養(yǎng)18 h后枯草芽孢桿菌快速生長并進(jìn)入對數(shù)生長期。在OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)24 h后枯草芽孢桿菌增長明顯加快，24～30 h為快速生長期。表明隨著OLE質(zhì)量濃度的增加，枯草芽孢桿菌的延遲期增長，對數(shù)生長期延后。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對數(shù)生長期分別為12～30 h、6～30 h，添加不同質(zhì)量濃度的OLE后均可延緩蠟狀芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌進(jìn)入對數(shù)生長期。生長曲線遲緩期的長短主要因菌種、接種量、菌齡及營養(yǎng)物質(zhì)等不同而異。本實(shí)驗(yàn)中遲緩期延長的原因可能是OLE中的活性成分作為菌體生長的抑制劑對其生長起到了抑制作用。

2.3.2 OLE對大腸桿菌生長曲線的影響(見圖2)

注：A為抗四環(huán)素大腸桿菌，B為大腸桿菌。

由圖2可知，抗四環(huán)素大腸桿菌組和大腸桿菌組的生長曲線趨勢趨于一致。不添加OLE時(shí)，培養(yǎng)6 h后細(xì)菌數(shù)開始快速增長并進(jìn)入對數(shù)生長期。當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，抗四環(huán)素大腸桿菌和大腸桿菌的對數(shù)生長期為18～30 h，此時(shí)對數(shù)生長期被延緩，細(xì)菌生長速率減慢且所需時(shí)間范圍變寬。當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，抗四環(huán)素大腸桿菌和大腸桿菌在培養(yǎng)18 h后細(xì)菌數(shù)迅速增加，在18～30 h為對數(shù)生長狀態(tài)，但菌體濃度低于5 mg/mL組。圖2(A)表明添加OLE既可以延緩抗四環(huán)素大腸桿菌進(jìn)入對數(shù)生長期的時(shí)間，又可以降低其菌體生長量，OLE對該菌株有較強(qiáng)的抑制作用。圖2(B)表明OLE對大腸桿菌的抑制作用相對較弱。油橄欖葉中酚類物質(zhì)具有抗腫瘤、抗癌作用，此外還有廣泛的抑菌和抗氧化作用，如橄欖苦苷、蘆丁、咖啡酸等及其一定比例混合物均顯示較強(qiáng)的體外活性，具有聯(lián)合抗菌作用。Lee等[14]發(fā)現(xiàn)橄欖葉提取物中的橄欖苦苷和咖啡酸均表現(xiàn)出對微生物的抑制作用，且組合酚類化合物的抗菌效果顯著高于酚類化合物單體。

2.3.3 OLE對葡萄球菌生長曲線的影響(見圖3)

注：A為表皮葡萄球菌，B為金黃色葡萄球菌(SH7)，C為金黃色葡萄球菌。

由圖3(A)可知，不添加OLE的培養(yǎng)基中表皮葡萄球菌培養(yǎng)12 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)24 h時(shí)進(jìn)入平穩(wěn)期，之后細(xì)菌數(shù)開始快速降低。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，表皮葡萄球菌在培養(yǎng)18 h之后細(xì)菌數(shù)增加較快，18 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)30 h后達(dá)到最大菌液濃度，此時(shí)表皮葡萄球菌對數(shù)生長期相對對照組被延緩，說明OLE對表皮葡萄球菌有一定抑菌作用。在OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，表皮葡萄球菌在培養(yǎng)6 h后繁殖較快，數(shù)目增加明顯，18 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)30 h后細(xì)菌數(shù)開始下降。由圖3(B)可知，當(dāng)不添加OLE時(shí)，金黃色葡萄球菌(SH7)在開始培養(yǎng)后持續(xù)快速增長。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)6 h細(xì)菌開始適應(yīng)環(huán)境，12 h后快速生長，對數(shù)生長期出現(xiàn)在培養(yǎng)12～36 h之間。OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌(SH7)生長曲線趨勢與5 mg/mL組相一致。由圖3(C)可知，不添加OLE時(shí)，培養(yǎng)6 h后金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)12 h后金黃色葡萄球菌菌數(shù)開始增加，18 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，相比對照組，此時(shí)對數(shù)生長期被延緩，細(xì)菌生長速率減慢。當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)18 h后細(xì)菌數(shù)迅速增加，于18 h達(dá)對數(shù)生長狀態(tài)。以上結(jié)果表明，OLE對葡萄球菌生長曲線的對數(shù)生長期均具有延緩作用。吳遵秋等[12]利用稀釋法分析了橄欖苦苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌生長曲線的影響，結(jié)果顯示橄欖苦苷對3種細(xì)菌生長曲線的影響均表現(xiàn)為延緩細(xì)菌的對數(shù)生長期，與本研究結(jié)果類似。植物源提取的酚類物質(zhì)具有廣譜的抑菌性，特別是黃酮類化合物，從不同物種中提取的黃酮類化合物抑菌作用均不相同。橄欖黃酮對變形桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，對痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用更強(qiáng)；橄欖黃酮對牛乳中微生物的活動(dòng)同樣具有抑制作用，而且隨著橄欖黃酮濃度的增加，抑菌作用明顯增加[15]。OLE對細(xì)菌對數(shù)生長期的延緩作用是其中多種活性物質(zhì)相互協(xié)同作用的結(jié)果。

2.3.4 OLE對銅綠假單胞菌生長曲線的影響(見圖4)

圖4 不同質(zhì)量濃度OLE對銅綠假單胞菌生長曲線的影響

由圖4可知，與對照組相比，當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，對銅綠假單胞菌的生長抑制作用較小，但是當(dāng)OLE質(zhì)量濃度增至10 mg/mL時(shí)，生長抑制作用較明顯，尤其是在生長后期。結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OLE對銅綠假單胞菌的生長抑制作用與其質(zhì)量濃度直接相關(guān)。已有的研究顯示橄欖黃酮和橄欖多酚對桿菌、葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著濃度的增加抑菌作用明顯增加[15-16]。因此，橄欖葉提取物中有效成分濃度與抑菌活性之間存在顯著的正相關(guān)性。

3 結(jié) 論

(1)采用稀釋法分析了OLE對8種致病菌的MIC和MBC。結(jié)果顯示，OLE與鹽酸小檗堿在測試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對銅綠假單胞菌無抑制作用，對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng)，對蠟狀芽孢桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑制作用較弱。

(2)OLE對8種致病菌的抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在OLE質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，OLE對大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，對大腸桿菌和抗四環(huán)素大腸桿菌的抑菌圈直徑分別可達(dá)(25.07±3.02)mm和(24.89±1.58)mm；金黃色葡萄球菌為極度敏感，金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌(SH7)抑菌圈直徑分別為(21.35±2.06)mm和(20.01±1.21)mm；而對芽孢桿菌抑制作用相對較弱，處于中度敏感狀態(tài)；對銅綠假單胞菌的抑制作用最弱，處于低度敏感狀態(tài)。

(3)OLE主要通過延長細(xì)菌生長的延遲期，延緩對數(shù)生長期和降低菌體濃度對測試菌起抑制作用，而且隨著OLE質(zhì)量濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。

以上結(jié)果表明，富含橄欖苦苷和黃酮類物質(zhì)的橄欖葉提取物具有較強(qiáng)的抑菌活性，在植物源綠色抑菌制劑開發(fā)領(lǐng)域具有良好的市場前景。