家蠅幼蟲耐高溫抗氧化蛋白的篩選及其功能研究

黃靖怡，柯德森

(廣州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣州510006)

家蠅(Muscadomestica)對各種不良環(huán)境具有高度適應(yīng)性，已作為一種資源昆蟲受到廣泛關(guān)注。而蠅蛆作為蠅的幼蟲，富含脂肪酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分及多種維生素和生物活性物質(zhì)，是一種寶貴的營養(yǎng)資源[1-2]。從蠅蛆中提取的蠅蛆油含有十分豐富的不飽和脂肪酸，不僅是維持生物體活動的重要成分，而且對皮膚損傷有良好的療效[3]，同時還可作為生物柴油的合成原料[4]。而蠅蛆蛋白質(zhì)含量豐富、種類多樣，具有良好的開發(fā)價值。研究發(fā)現(xiàn)，從蠅蛆中可提取抗菌譜廣、殺菌能力強(qiáng)的抗菌物質(zhì)(一般為多肽類物質(zhì))，且該類抗菌物質(zhì)普遍存在耐高溫的特性[5]。Ai等[6-7]相繼發(fā)現(xiàn)蠅蛆富含的蛋白質(zhì)組分顯示出優(yōu)異的肝保護(hù)活性、禽流感病毒H9N2等病毒的抗病毒性、DPPH自由基與超氧陰離子自由基清除活性及免疫調(diào)節(jié)功能。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)家蠅幼蟲蛋白水解物具有較高的綜合抗氧化活性。

當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時，會產(chǎn)生過多活性氧(Reactive oxygen species，ROS)使機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，發(fā)生脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷，其中細(xì)胞膜系統(tǒng)將首先受到活性氧的攻擊。而研究表明，活性氧堆積及引發(fā)的一系列反應(yīng)是衰老及許多疾病的誘發(fā)因素[9-12]。目前，用于抵御脂質(zhì)過氧化等氧化損傷反應(yīng)所需抗氧化劑包括化學(xué)合成抗氧化劑[13]及天然抗氧化劑[14]，但前者存在潛在的毒性作用，而后者在生產(chǎn)應(yīng)用過程中會因高溫等不良環(huán)境導(dǎo)致活力喪失，故開發(fā)兼具耐高溫特性的天然抗氧化劑有重要意義，其中抗氧化肽因其微量高效等特點(diǎn)，成為天然抗氧化劑的研究熱點(diǎn)。

基于抗氧化肽等天然抗氧化產(chǎn)品在生產(chǎn)應(yīng)用中存在的活性成分不穩(wěn)定現(xiàn)狀及蠅的環(huán)境適應(yīng)性特點(diǎn)，本研究對蠅蛆蛋白進(jìn)行高溫處理及體外抗氧化能力的綜合評價，篩選具有較高溫度耐受性的抗氧化蛋白，探究其對H2O2誘導(dǎo)損傷的H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討蠅蛆耐高溫蛋白抗氧化活性效應(yīng)，為優(yōu)質(zhì)蛋白資源開發(fā)及其在食品、保健品產(chǎn)業(yè)及飼料業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

家蠅(Muscadomestica)幼蟲，由廣州市小衛(wèi)生物技術(shù)有限公司提供，為經(jīng)冷凍保存的3齡蟲。NBT，上海麥克林生化科技有限公司；TPTZ，阿拉丁試劑股份有限公司；H9c2細(xì)胞，中山大學(xué)惠贈；Cell Counting Kit-8、LDH、BCA、SOD、CAT、GSH試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Bio-Rad蛋白電泳系統(tǒng)(配有PowerPac通用電泳儀電源和 mini-PROTEAN Tetra手灌膠系統(tǒng))，美國Bio-Rad公司；Gel Doc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；FreeZone 6 L立式凍干機(jī)，美國Labconco公司；infinite 200Pro酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Agilent 1220 Infinity高效液相色譜儀(配有紫外檢測器和OpenLAB CDS ChemStation色譜工作站)，美國Agilent 公司；CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；HERAcell150i CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品高溫處理及蛋白質(zhì)含量測定

家蠅幼蟲與去離子水以1∶10的比例研磨2 min，靜置5 min并用8層紗布過濾，4℃、12 000 r/min 高速離心30 min，去除上層油脂及沉淀，留清液。取等量清液分別進(jìn)行60、80、100℃加熱處理，前30 min每5 min取1次樣，共處理1 h。處理后樣品經(jīng)4℃、12 000 r/min高速離心10 min，取上清液作為蠅蛆蛋白提取液備用。參考Grintzalis等[15]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測蠅蛆樣液蛋白質(zhì)含量，檢測波長595 nm。

1.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

對Wu等[16]的方法作適當(dāng)修改。采用10%的分離膠和4%的濃縮膠及考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察，檢測樣品的蛋白質(zhì)分布。

1.2.3 體外抗氧化能力測定

1.2.3.1 羥自由基清除能力

參考農(nóng)石生等[17]水楊酸法測定羥自由基清除能力。取適當(dāng)稀釋樣品與2 mmol/L FeSO4溶液、2 mmol/L水楊酸醇溶液、0.3% H2O2混合，于37℃水浴反應(yīng)1 h。以50%乙醇為參比，510 nm下測吸光值。

式中：A0為對照組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為不含H2O2的樣品本底吸光值。

1.2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力

參考Pandey等[18]NBT法測定超氧陰離子自由基清除能力。樣品按梯度稀釋，與13 mmol/L甲硫氨酸、63 μmol/L NBT、1.3 μmol/L核黃素、0.1 mmol/L EDTA-2Na(溶液均以pH 7.8、0.05 mol/L磷酸緩沖液配制)混合。光照15 min，設(shè)置空白對照與暗對照，測定樣品吸光值，檢測波長560 nm。其中加樣量控制在A樣品為A空白的一半左右。

超氧陰離子自由基清除活力=

式中：A空白為不加樣品(空白對照)吸光值；A黑暗為不光照不加樣品(暗對照)吸光值；A樣品為樣品吸光值；V加樣為檢測時加樣體積，mL；V總為樣液總體積，mL；W鮮重為樣品鮮重，g。

1.2.3.3 還原力

參照Benzie等[19]FRAP法測定樣品還原力。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，還原力以達(dá)到相同吸光值對應(yīng)的FeSO4毫摩爾數(shù)表示。

1.2.4 疏水性分析

參照貢雯玉等[20]方法作適當(dāng)修改，采用反相液相色譜法(RP-HPLC)分析樣品的疏水性。色譜條件：Agilent 1220 Infinity高效液相色譜儀，RGL8565 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為10%甲醇溶液，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫(35±0.8)℃。

1.2.5 H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷模型的建立

H9c2細(xì)胞用含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%時，加入胰蛋白酶消化。將H9c2細(xì)胞以1×105個/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后分為6組，對照組不作處理，實(shí)驗(yàn)組分別給予由DMEM培養(yǎng)液配制的200、400、600、800 μmol/L的H2O2處理，每組5個復(fù)孔，分別作用8、12、24 h后，棄培養(yǎng)液，用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率(測定條件為加CCK后孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光值)。

式中：A處理為含有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光值；A對照為含有細(xì)胞、CCK溶液的孔的吸光值；A空白為含有培養(yǎng)基和CCK溶液的孔的吸光值。

1.2.6 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞的毒性測定

將H9c2細(xì)胞以1×105個/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分成5組，對照組加入含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別給予由DMEM培養(yǎng)液配制的0.5、1、2、4 mg/mL的蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白處理，每組5個復(fù)孔，分別作用8、12、24 h后，棄培養(yǎng)液，用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。

1.2.7 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H2O2誘導(dǎo)損傷的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

將H9c2細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置對照組、H2O2損傷模型組和給藥組，對照組不作處理，H2O2損傷模型組給予600 μmol/L的H2O2處理8 h，給藥組分別用0.5、1、2、4 mg/mL蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白預(yù)孵12、24 h后，換入600 μmol/L的H2O2處理8 h，用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。

1.2.8 細(xì)胞形態(tài)觀察

H9c2細(xì)胞以1×105個/mL培養(yǎng)于6孔板中并按1.2.6及1.2.7條件進(jìn)行處理，在倒置顯微鏡下(×100)觀察細(xì)胞形態(tài)，并用其配備的專用數(shù)碼相機(jī)拍攝正常對照組、損傷模型組、給藥組的典型細(xì)胞形態(tài)。

1.2.9 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H2O2誘導(dǎo)損傷的H9c2細(xì)胞胞外LDH及胞內(nèi)氧化還原酶系的影響

細(xì)胞以1×105個/mL接種于6孔板中，按1.2.7條件進(jìn)行處理。收集細(xì)胞上清液檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量。此后，收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(Cell Lysis Buffer-10X)處理細(xì)胞，離心并取上清液(離心條件：13 200 r/min，4℃，6 min)，檢測蛋白質(zhì)含量(BCA法)及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力與還原型谷胱甘肽(GSH)含量。LDH含量、蛋白質(zhì)含量及各氧化還原酶系的檢測按試劑盒說明書操作。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Excel2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD 多重比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠅蛆耐高溫蛋白篩選

圖1、圖2分別為不同溫度處理的蠅蛆蛋白提取液蛋白質(zhì)含量變化及SDS-PAGE分析結(jié)果。由圖1、圖2可見：未經(jīng)高溫處理的樣品蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量主要集中在80～90 kDa；60℃處理的樣品蛋白質(zhì)含量略有下降，且主要集中在30～40 kDa，而處理時間對樣品蛋白質(zhì)含量影響不顯著(P>0.05)；80℃處理20 min及100℃處理5 min樣品中蛋白質(zhì)含量明顯下降(P<0.05)，且在40 kDa及20 kDa附近得到清晰條帶。表明80℃以上高溫加熱能有效除去樣品中不耐熱蛋白，實(shí)現(xiàn)蛋白樣品的初步純化，而100℃處理用時更短，純化效果更佳。

圖1 60、80、100℃處理的蠅蛆蛋白提取液蛋白質(zhì)含量變化

注：泳道1～8表示各溫度下處理0、5、10、15、20、25、30、60 min的樣品；M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2.2 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白的篩選

對不同溫度處理的蠅蛆蛋白提取液進(jìn)行抗氧化能力測定，結(jié)果見圖3。由圖3可見，60℃處理僅對蠅蛆蛋白提取液還原力有顯著降低作用(P<0.05)，而80℃和100℃處理對蠅蛆蛋白提取液的還原力及超氧陰離子自由基清除能力均有顯著降低作用(P<0.05)，其中超氧陰離子自由基清除能力在100℃處理20 min后趨于穩(wěn)定。此外，不同溫度處理不同時間對蠅蛆蛋白提取液羥自由基清除能力無顯著影響(P>0.05)，清除率基本可達(dá)到70%，說明蠅蛆中可能存在清除羥自由基的有效成分，且該成分具有良好的熱穩(wěn)定性。結(jié)合圖1、圖2結(jié)果，證明蠅蛆耐高溫蛋白具有超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力及還原力，初步推測其抗氧化能力可能與40 kDa及約20 kDa的蛋白有關(guān)，且該范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)在80～100℃高溫下仍能保持生物活性。蠅蛆蛋白的抗氧化性在前人研究[21-22]中已得到驗(yàn)證，而本研究發(fā)現(xiàn)蠅蛆耐高溫蛋白在多種體外抗氧化系統(tǒng)中也具有較好的生物活性，有望成為良好的耐高溫抗氧化功能蛋白的來源。 從作用效果等角度考慮，確定篩選耐高溫抗氧化蛋白的優(yōu)化條件為100℃處理20 min，對此條件下的蠅蛆蛋白提取液進(jìn)行冷凍干燥處理，得到蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白凍干粉。

圖3 60、80、100℃處理的蠅蛆蛋白提取液的抗氧化活性

2.3 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白的疏水性

根據(jù)1.2.4，對未經(jīng)高溫加熱處理以及100℃處理20 min的蠅蛆蛋白提取液進(jìn)行疏水性分析，結(jié)果見圖4。

注：a、b分別為未經(jīng)高溫加熱處理樣品與100℃高溫處理20 min的樣品。

圖4 蠅蛆蛋白提取液反相液相色譜圖

由圖4可見，未經(jīng)高溫加熱處理的樣品出現(xiàn)3個清晰主峰，峰1、2、3保留時間分別為2.887、4.304、5.544 min，其中峰3的峰面積大于峰1、2，占總峰面積的41.7%。100℃處理20 min的蠅蛆蛋白提取液在3 min以前基本無明顯出峰，在4～7 min范圍內(nèi)出現(xiàn)3個明顯峰，峰間有重疊。與未進(jìn)行高溫加熱處理的樣品相比，總峰面積下降約50%，出峰時間略有后移。說明經(jīng)高溫加熱處理后，蠅蛆蛋白提取液中疏水性相對較弱的蛋白量大幅下降，疏水性相對較強(qiáng)的蛋白被較好地保留下來，推測耐高溫蛋白具有較好的疏水性，該結(jié)果與楊楠等[23]研究結(jié)果相符。

2.4 H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷模型

H2O2處理可導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，高濃度H2O2甚至引起細(xì)胞凋亡，因而H2O2常被用于細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建[24]。通過探討H2O2濃度及處理時間對H9c2細(xì)胞存活率的影響，構(gòu)建H2O2氧化損傷模型，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見：H9c2存活率與H2O2濃度及處理時間呈一定相關(guān)性，相同處理時間下，隨著H2O2濃度增加，細(xì)胞存活率下降(P<0.05)；而相同H2O2濃度下，隨著處理時間的延長，H9c2存活率出現(xiàn)不同程度下降(P<0.05)；400 μmol/L的H2O2處理12 h或600 μmol/L的H2O2處理8 h，H9c2存活率均達(dá)到50%左右，與對照組差異顯著(P<0.05)，符合H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型的建立條件。綜合時間、效率等因素考慮，選取600 μmol/L H2O2處理8 h為建模條件用于后續(xù)研究。

圖5 H2O2濃度及處理時間對H9c2細(xì)胞存活率的影響

2.5 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞的毒性分析

蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞存活率的影響如圖6所示。由圖6可見，蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白質(zhì)量濃度在0.5～4 mg/mL范圍內(nèi)，分別處理H9c2細(xì)胞8、12、24 h，各處理時間下H9c2細(xì)胞存活率與對照組無顯著差異(P>0.05)。此外，該蛋白未見明顯劑量依賴性(P>0.05)，不同處理時間H9c2細(xì)胞存活率間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞無明顯毒性作用。

圖6 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白劑量及處理時間對H9c2細(xì)胞存活率的影響

2.6 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H2O2誘導(dǎo)損傷的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白預(yù)孵育12、24 h后，600 μmol/L H2O2處理8 h，CCK-8法測定細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖7所示。由圖7可見，與正常對照組相比，H2O2模型組H9c2細(xì)胞存活率下降至約46%(P<0.05)，而經(jīng)過不同質(zhì)量濃度的蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白12、24 h預(yù)孵育后，H9c2細(xì)胞存活率明顯提高，最大可提高約39%(P<0.05)，并顯示出一定范圍內(nèi)的劑量依賴性。相對于12 h預(yù)孵育，24 h預(yù)孵育能顯著提高細(xì)胞存活率(P<0.05)。推測蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，并確定24 h為較佳預(yù)孵育時間。

注：同一預(yù)孵時間不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

圖7 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用

2.7 細(xì)胞形態(tài)

不同處理?xiàng)l件對H9c2細(xì)胞形態(tài)的影響如圖8所示。

注：a.對照組；b.600 μmol/L H2O2損傷8 h；c.4 mg/mL蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白保護(hù)24 h后600 μmol/L H2O2損傷8 h；d.4 mg/mL蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白保護(hù)24 h。

圖8 不同處理對H9c2細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

由圖8a可見，細(xì)胞呈長梭形，貼壁緊密，生長狀況良好。由圖8b可見，600 μmol/L H2O2處理8 h后，細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)出現(xiàn)較大改變，細(xì)胞皺縮呈現(xiàn)圓形，且堆積成團(tuán)，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞漂浮，說明該條件下H2O2處理對H9c2細(xì)胞具有明顯氧化損傷作用，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大改變。由圖8c可見，蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白保護(hù)24 h后，H2O2處理對H9c2細(xì)胞的損傷程度明顯降低，部分細(xì)胞因損傷而皺縮呈圓形，但大部分細(xì)胞呈長梭形，貼壁情況較好，表明蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白在一定程度上能保護(hù)H9c2細(xì)胞，降低H2O2對其造成的氧化損傷。由圖8d可見，4 mg/mL蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白保護(hù)24 h后，細(xì)胞分布均勻，形態(tài)正常，呈長梭形，貼壁緊密，未見明顯損傷。0.5～2 mg/mL蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白處理后H9c2細(xì)胞形態(tài)與4 mg/mL蛋白處理結(jié)果相似，表明在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞無明顯毒害作用。H9c2細(xì)胞形態(tài)變化與細(xì)胞存活率結(jié)果基本吻合。

2.8 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H2O2誘導(dǎo)損傷的H9c2細(xì)胞胞外LDH及胞內(nèi)氧化還原酶系的影響

乳酸脫氫酶(LDH)是一種胞內(nèi)酶，細(xì)胞損傷或凋亡會導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)LDH釋放到培養(yǎng)液中，檢測給藥前后培養(yǎng)液中LDH含量，可評估蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞膜的保護(hù)作用，LDH釋放可作為細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)。超氧化物歧化酶(SOD)可清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的超氧化物陰離子，其活力高低可反映細(xì)胞抵抗氧化損傷的能力；過氧化氫酶(CAT)是體內(nèi)清除過氧化氫，降低其導(dǎo)致的機(jī)體氧化損傷的重要抗氧化酶；而谷胱甘肽過氧化物酶可通過還原型谷胱甘肽(GSH)清除機(jī)體中的過氧化氫及脂類過氧化物，有效阻止活性氧自由基對機(jī)體的氧化損傷。蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的LDH釋放及胞內(nèi)氧化還原酶系的影響見表1。由表1可見，H2O2損傷模型組細(xì)胞中LDH含量顯著提高(P<0.05)，而SOD活力、CAT活力及GSH含量顯著下降(P<0.05)，表明600 μmol/L H2O2處理8 h可導(dǎo)致H9c2細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，大量LDH釋放到培養(yǎng)液中，胞內(nèi)氧化還原酶系受到破壞；而蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白預(yù)處理后，與H2O2損傷模型組相比，細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH含量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞中的SOD活力、CAT活力及GSH含量顯著提高(P<0.05)，表明蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞有一定保護(hù)作用，可有效降低H2O2對細(xì)胞膜系統(tǒng)及細(xì)胞內(nèi)氧化還原酶系造成的氧化損傷，可減少細(xì)胞膜破裂，降低LDH釋放。此外，該樣品在一定范圍內(nèi)存在劑量依賴性，4 mg/mL 給藥處理后LDH釋放量出現(xiàn)較明顯降低(降低24%)，SOD活力、CAT活力及GSH含量均高于0.5～2 mg/mL 的給藥處理。此結(jié)果與趙春江等[25]的結(jié)果相似，證明蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白具有較好的抗氧化活性。

表1 蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H9c2細(xì)胞的LDH釋放及胞內(nèi)氧化還原酶系的影響

注：同列不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié) 論

通過加熱法從蠅蛆中獲得了熱穩(wěn)定性蛋白，在100℃處理20 min的條件下，對體外抗氧化能力綜合評價發(fā)現(xiàn)所得蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白具有良好的超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力和還原力。對細(xì)胞存活率、LDH釋放及SOD活力、CAT活力、GSH含量等與細(xì)胞抗氧化酶系相關(guān)指標(biāo)的檢測證明，獲得的蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白對H2O2誘導(dǎo)損傷的H9c2細(xì)胞有保護(hù)作用，且在一定范圍內(nèi)存在劑量依賴性。提示蠅蛆耐高溫抗氧化蛋白可提高細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活力，降低活性氧自由基對細(xì)胞造成的氧化損傷。