黑土微生物群落對(duì)副球菌屬(Paracoccus sp.)QD15-1修復(fù)鄰苯二甲酸二甲酯污染土壤的響應(yīng)*

朱曉慧 劉 虹 郭茹鑫 王恒煦 王志剛

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)已成為全球主要的環(huán)境污染物之一[1-2]，PAEs的生物降解成本低、降解速率快，且一般無(wú)二次污染[3-4]。目前，我國(guó)土壤中PAEs含量已達(dá)到mg/kg數(shù)量級(jí)，部分土壤中的PAEs達(dá)4.90 mg/kg[5-6]，其中鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)是PAEs中檢出率較高的污染物之一[7-8]。DMP污染會(huì)引起黑土微生物群落發(fā)生變化，從而對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)造成損害[9]，急需行之有效的修復(fù)技術(shù)。

黑土是我國(guó)最具價(jià)值的土壤類型之一[10]。據(jù)估計(jì)，1 g黑土中含有10億個(gè)微生物[11]，土壤微生物與植物生長(zhǎng)和土壤肥力密切相關(guān)[12]，微生物也是土壤乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分[13]，其對(duì)環(huán)境的作用是通過(guò)多種代謝方式和生理功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，微生物多樣性被認(rèn)為是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量變化的重要指示因子[14]，基于微生物群落的物種信息分析被廣泛應(yīng)用于土壤環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)[15-18]。

生物修復(fù)因其高效、低成本等優(yōu)點(diǎn)，備受關(guān)注。DMP作為副球菌屬(Paracoccussp.)QD15-1的唯一碳源，副球菌屬Q(mào)D15-1能高效降解土壤中的DMP[19]。生物修復(fù)是修復(fù)PAEs污染土壤的有效技術(shù)。研究土壤微生物群落對(duì)微生物修復(fù)的響應(yīng)具有一定的科學(xué)意義，但其在修復(fù)DMP污染土壤過(guò)程中微生物群落的響應(yīng)過(guò)程尚不明確，深入研究微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性影響因素能為微生物修復(fù)提供有效的理論依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要供試材料與培養(yǎng)基

降解菌：齊齊哈爾大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供的副球菌屬Q(mào)D15-1(-80 ℃保存)。

DMP、甲醇、丙酮、乙酸乙酯均為分析純?cè)噭?/p>

黑土：采集自齊齊哈爾克山農(nóng)場(chǎng)(125°7′E，48°11′N)，未檢測(cè)到DMP，由黏土、細(xì)粉砂、粗粉砂、砂粒組成，有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～8%，有機(jī)質(zhì)為75.1 g/kg，pH為5.8。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：氯化銨2.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，磷酸二氫鉀0.4 g/L，痕量元素儲(chǔ)備液2 mL/L。其中痕量元素儲(chǔ)備液：CaSO4·5H2O 4.0 g,FeSO4·7H2O 7.0 g,FeCl3·6H2O 7.0 g,CoCl2·6H2O 0.2 g，NaMnO4·2H2O 3.4 g，CaCl22.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0

1.2 菌種的活化與收集

取1 mL降解菌于100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，4 000 r/min下離心3 min，用生理鹽水洗滌2次，垂懸于10 mL的生理鹽水中。8 000 r/min下離心5 min，收集降解菌菌體。

1.3 降解實(shí)驗(yàn)

取黑土每份500 g，添加不同濃度DMP溶液(溶劑載體為90%(體積分?jǐn)?shù))丙酮)混勻，依次得到0、100、200、400 mg/kg的DMP污染土壤。隨后將DMP污染土壤放置于培養(yǎng)皿中，并添加1 mL降解菌菌液(600 nm處吸光度為1，菌落數(shù)為3×108cfu/mL)，攪拌均勻，將培養(yǎng)皿放置于人工氣候箱(25 ℃、空氣濕度60%、土壤濕度30%)中培養(yǎng)21 d。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并以黑土為對(duì)照組，以未加降解菌的土壤自然降解為參考。

1.4 液相色譜法測(cè)定土壤中DMP濃度

選取培養(yǎng)0～21 d的DMP污染土壤，每個(gè)處理平行取樣3次，每組10 g，以黑土作對(duì)照組，以未加降解菌的土壤中自然降解為參考。色譜流動(dòng)相為10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)超純水、90%甲醇，254 nm，使用Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色譜儀測(cè)定每個(gè)階段土壤中DMP濃度。由DMP標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(Y，mg/kg)及峰值(X)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如式(1)所示。

Y=0.201 8X-47.954，R2=0.997

(1)

1.5 高通量測(cè)序法測(cè)定土壤中微生物群落的變化

從培養(yǎng)7、21 d的0、200、400 mg/kg處理的DMP污染土壤中平行取樣，每組10 g，分別標(biāo)記為7 d-0、7 d-200、7 d-400、21 d-0、21 d-200、21 d-400。通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序法測(cè)定土壤中微生物群落的分布與變化。

本研究委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，最終得到操作分類單元(OTU)聚類分析和物種分類學(xué)分析結(jié)果。根據(jù)分析結(jié)果，本研究對(duì)多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息深入進(jìn)行多元分析和差異顯著性檢驗(yàn)等一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中DMP濃度

由圖1可知，加入降解菌后DMP降解明顯，7 d內(nèi)可有效將不同濃度的DMP降解，隨時(shí)間延長(zhǎng)，曲線趨于平緩；直至21 d時(shí)污染土壤中DMP趨向0 mg/kg。降解菌在土壤中可降解大部分DMP，平均降解率為94.7%。與未加入降解菌污染土壤自然降解條件下的DMP濃度產(chǎn)生鮮明對(duì)比，因此降解菌在土壤中有著良好的降解效果。

圖1 不同條件下DMP污染土壤的降解Fig.1 Degradation rate of DMP in contaminated soil under different conditions

2.2 土壤中微生物豐富性和多樣性的變化

OUT水平的Shannon、Sobs指數(shù)分別表征微生物多樣性、豐富性。土壤中微生物的稀釋曲線見(jiàn)圖2。隨DMP濃度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)，Shannon指數(shù)降低；隨測(cè)序數(shù)據(jù)量增加，Shannon指數(shù)稀釋曲線趨于平緩。說(shuō)明在時(shí)間延長(zhǎng)及DMP濃度增大的情況下，土壤中絕大多數(shù)的微生物多樣性改變。隨測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加，Sobs指數(shù)稀釋曲線緩慢升高，并且覆蓋度大，能覆蓋樣本中的絕大部分物種，物種數(shù)量多，在時(shí)間延長(zhǎng)后可能會(huì)出現(xiàn)新的種群，增多群落豐富性。

2.3 DMP影響的土壤中微生物群落變化

由圖3可知，土壤樣本中含有22個(gè)菌門，其中放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門的相對(duì)豐度較高。DMP污染土壤加入降解菌培養(yǎng)7 d后的優(yōu)勢(shì)門為放線菌門；與7 d相比，DMP污染土壤加入降解菌培養(yǎng)21 d后放線菌門增加而變形菌門減少，優(yōu)勢(shì)門依然為放線菌門，占總菌門數(shù)的50%以上，也恰好證明培養(yǎng)7 d后土壤狀態(tài)可達(dá)到穩(wěn)定。

DMP導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)屬水平的改變，主要為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、微球菌屬(Micrococcaceae)、地桿菌屬(Terrabacter)、小單孢菌屬(Micromonospora)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等。由圖4可見(jiàn)，總體上，土壤中鞘氨醇單胞菌屬是第一優(yōu)勢(shì)菌屬，第二優(yōu)勢(shì)菌屬為類諾卡氏菌屬。培養(yǎng)7 d，隨DMP濃度的增加，鞘氨醇單胞、類諾卡氏、小單孢菌屬相對(duì)豐度下降，微球、鏈霉菌屬相對(duì)豐度先升高后降低，地桿菌屬相對(duì)豐度升高。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)21 d，所有菌屬相對(duì)豐度變化趨勢(shì)與7 d均一致，但類諾卡氏、微球、地桿菌屬相對(duì)豐度升高，鞘氨醇單胞、小單孢、鏈霉菌屬相對(duì)豐度下降。證明DMP污染后，影響土壤中細(xì)菌群落組成，降解菌在7 d修復(fù)后，土壤內(nèi)環(huán)境菌屬大致達(dá)到平衡。

圖2 土壤中微生物的稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of microorganism in soil

圖3 土壤細(xì)菌群落熱圖和樣本聚類分析Fig.3 Analysis of heatmap and sample clustering of soil bacterial community

圖4 土壤細(xì)菌群落屬水平物種組成Fig.4 Soil bacterial community genus level species composition column diagram

通過(guò)主成分(PCA)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與添加了DMP的處理組細(xì)菌群落組成有明顯差異，可能是由于受到高濃度DMP的影響。主成分1和主成分2對(duì)結(jié)果的解釋度分別為39.02%和33.51%，說(shuō)明DMP雖然影響了土壤中細(xì)菌群落組成，但降解菌降解基本完全，土壤得以修復(fù)，并保持穩(wěn)定。21 d后200、400 mg/kg DMP污染土壤中細(xì)菌群落組成差異不大，群落組成依舊保持穩(wěn)定，這與物種相對(duì)豐度(見(jiàn)圖4)相互呼應(yīng)。

3 討 論

金雷等[20]在長(zhǎng)期受垃圾污染的土壤中篩選出一株降解率可達(dá)到82.7%的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)降解菌，該菌株在含有100 mg/L的DBP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5 d就可降解大部分DBP。張永樂(lè)等[21]分離了一株用于溴苯腈降解的副球菌屬M(fèi)XX-04，能以溴苯腈為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，降解率為95.3%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在含有不同濃度DMP污染土壤中，降解菌7 d可降解大部分DMP，平均降解率較高，達(dá)到94.7%，并且直至21 d并未有太大改變。WANG等[22]通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，DBP污染改變了土壤中屬的相對(duì)豐度，并改變了細(xì)菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)；真菌群落的Shannon指數(shù)在DBP為5 mg/kg時(shí)上升，40 mg/kg時(shí)降低。本研究中隨DMP濃度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)，Shannon指數(shù)降低；隨測(cè)序數(shù)據(jù)量增加，Shannon稀釋曲線趨于平緩。說(shuō)明DMP濃度的改變導(dǎo)致土壤中群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

祁燕云等[23]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物修復(fù)石油污染土壤過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，利用生物強(qiáng)化修復(fù)處理的土壤中，變形菌門為主要的優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度由修復(fù)前的37.44%增加為87.44%；假單胞菌屬(Pseudomonas)成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度由2.99%增加為76.37%。本實(shí)驗(yàn)土壤中微生物優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門、變形菌門，DMP污染土壤加入降解菌培養(yǎng)7 d后的優(yōu)勢(shì)門為放線菌門；與7 d相比，DMP污染土壤加入降解菌培養(yǎng)21 d后放線菌門增加而變形菌門減少，優(yōu)勢(shì)門依然為放線菌門，占總菌門數(shù)的50%以上；土壤中鞘氨醇單胞菌屬是第一優(yōu)勢(shì)菌屬，第二優(yōu)勢(shì)菌屬為類諾卡氏菌屬。文獻(xiàn)[23]和本研究共同存在變形菌門，但放線菌門、屬不一致。并且，本研究未發(fā)現(xiàn)副球菌屬，可能是由于DMP作為唯一碳源，DMP被降解后，菌屬無(wú)生存能力而死亡。

王志剛等[24]發(fā)現(xiàn)，黑土微生物豐富性和多樣性受到DMP污染的抑制，且10、20、40 mg/kg處理的抑制效應(yīng)在25 d內(nèi)并未消除。本實(shí)驗(yàn)中黑土微生物豐富性和多樣性同樣受到DMP污染的抑制，但也恰好證明降解菌株可高效地在7 d內(nèi)降解大部分DMP，直到21 d并未發(fā)生反復(fù)(見(jiàn)圖1)。從細(xì)菌門、屬的水平看，DMP影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 語(yǔ)

(1) 副球菌屬Q(mào)D15-1在7 d內(nèi)可快速有效降解土壤中的DMP，平均降解率為94.7%，并能保持穩(wěn)定；土壤中的優(yōu)勢(shì)門為放線菌門，占總菌門數(shù)的50%以上；鞘氨醇單胞菌屬是第一優(yōu)勢(shì)菌屬，第二優(yōu)勢(shì)菌屬為類諾卡氏菌屬。

(2) 土壤樣品的高通量測(cè)序反映了土壤在不同DMP條件下微生物的物種多樣性和豐富性的改變。還需進(jìn)一步深入探究7 d內(nèi)降解的土壤微生物群落變化。在達(dá)到既不損害土壤內(nèi)部環(huán)境的條件下，降解污染物與保護(hù)環(huán)境兼顧一體，為微生物工業(yè)降解推廣應(yīng)用提供有利條件。