豬鏈球菌流行優(yōu)勢菌株的調(diào)查及耐藥性

王治方，白紅杰，徐引弟,朱文豪，張青嫻，焦文強，李海利，許 峰，王克領(lǐng)，張 彬，婁治國

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.河南省農(nóng)業(yè)科學院，河南 鄭州 450002)

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的一類急性、熱性傳染性疾病，屬于國家規(guī)定的二類動物傳染病，臨床上主要引起豬的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎等病癥，是世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)最常見的細菌性疾病之一[1-2]。

豬鏈球菌血清型較多，基于豬鏈球菌莢膜多糖抗原的不同，豬鏈球菌一度被分為35個血清型，分別是1～34和1/2型；2005年，HILL等[3]進一步驗證，32型和34型并不是豬鏈球菌，豬鏈球菌劃分為33個血清型(1/2型、1～31型、33型)；而有最新的研究報告指出，血清型20型、22型、26型和33型屬于其他新的物種，應(yīng)該從豬鏈球菌中分離出來[4]。因此，目前認為豬鏈球菌有29個血清型。豬鏈球菌的致病性與其攜帶的毒力基因密切相關(guān)，目前研究較多的豬鏈球菌主要毒力基因有胞外因子(extracellular protein fateror，epf)、溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein，mrp)和溶血素(suilysin，sly)，這3個毒力基因常作為豬鏈球菌致病性的指示蛋白基因。目前普遍認為豬鏈球菌血清1/2型、1型、2型、7型和9型對豬的致病性較強，其中2型毒力最強、流行最廣，而且能夠引起人類的感染發(fā)病和死亡，是國內(nèi)防控豬鏈球菌病的主要血清型。

近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)集約、規(guī)模化的發(fā)展，豬鏈球菌病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，而且經(jīng)常作為主要病原繼發(fā)于豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬圓環(huán)病毒等病毒性疾病，給養(yǎng)豬場臨床疾病診療控制帶來不小的困難，給養(yǎng)豬企業(yè)造成不小的經(jīng)濟損失。本試驗通過對2019年度河南省豬場疑似豬鏈球菌病例采集病料95份，通過病菌分離培養(yǎng)、純化鑒定，獲得豬鏈球菌68株，同時對68株豬鏈球菌進行了 血清型鑒定、藥敏試驗、毒力基因和耐藥基因檢測研究，旨在探討近段時間河南省豬鏈球菌流行優(yōu)勢菌株及其毒力基因和耐藥基因分布情況，為臨床豬鏈球菌的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料2019年度河南省不同規(guī)模的豬場臨床發(fā)生有腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等疑似豬鏈球菌病例病料，剖檢瀕死期病豬，采集腦組織、心血和關(guān)節(jié)液病料95份(分別采自鶴壁12份、焦作10份、駐馬店15份、南陽12份、周口16份、平頂山8份、濟源8份、開封5份和洛陽9份)。

1.2 主要試劑胰蛋白大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白大豆肉湯(TSB)購自美國Difco公司；新生犢牛血清購自鄭州益康生物工程有限公司；革蘭染液試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；6大類18種常用抗生素標準藥敏片，其中15種購自杭州濱河微生物試劑有限公司，頭孢噻呋、替米考星、土霉素藥敏片購自Sigma公司；微生物DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、Lording Buffer、2×Taq Master Mix等均購自寶生物(大連)工程有限公司；相關(guān)引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 病原的分離、純化無菌操作，將采集的疑似豬鏈球菌病例的病料腦、心血和關(guān)節(jié)液分別劃線接種于TSA平板(含5%的新生牛血清)，放置于培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18～24 h后，挑選可疑單個菌落純化、革蘭染色鏡檢。同時將純化后的可疑菌株分別接種于TSB液體培養(yǎng)基(含5%的新生牛血清)，于37℃培養(yǎng)18 h，備用。

1.4 分離菌株的PCR檢測、血清型鑒定

1.4.1引物設(shè)計 參照文獻[5-7]設(shè)計合成豬鏈球菌通用引物和29種血清型引物。

通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)對純化好的分離菌株進行鑒定和血清型分型鑒定。

1.4.2DNA提取 取可疑菌株TSB液體培養(yǎng)物1 mL于離心管中，10 000 r/min離心5 min,棄上清收集菌體沉淀，按照DNA提取試劑盒說明書提取菌體DNA，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3PCR檢測 PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×Taq Master Mix 13 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL，模板DNA 2 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預變性 5 min；95℃ 變性30 s,56℃ 退火30 s,72℃ 延伸30 s,40個循環(huán)；72℃延伸5 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

電泳：取10 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測，紫外透射分析儀觀察結(jié)果，比照DL2000 DNA Marker確定條帶大小。陽性PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果進行BLAST軟件比對。

1.5 毒力基因檢測

1.5.1引物設(shè)計 參考文獻[8-10]設(shè)計合成了3對豬鏈球菌毒力基因(胞外因子epf基因、溶血素sly基因、溶菌酶釋放蛋白mrp基因)引物,各對引物序列和擴增片段長度見表1。

表1 毒力基因引物序列及相關(guān)信息

1.5.2DNA提取及毒力基因檢測 DNA提取方法同上述1.4.2。毒力基因PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×Taq Master Mix 13 μL,上、下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL，模板DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預變性5 min;95℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 30 s，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩ｋ娪荆喝?0 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測，紫外透射分析儀觀察結(jié)果，比照DL2000 DNA Marker確定條帶大小。

1.6 藥物敏感性試驗藥敏試驗采用Kirby-Bauer(K-B)紙片擴散法[11-12]。具體方法及判定標準參照(美國臨床實驗室標準委員會NCCLS)(2005)標準。判定結(jié)果分為敏感、中介、耐藥。6大類18種抗生素包括頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林、青霉素、氨芐西林、卡那霉素、阿米卡星、壯觀霉素、替米考星、阿奇霉素、四環(huán)素、強力霉素、土霉素、左氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和復方新諾明。

1.7 耐藥基因檢測

1.7.1引物合成 參考文獻[13-15]，合成5大類24個耐藥基因包括β內(nèi)酰胺類(blaTEM、blaOXA-1、blaCTX-M-2、blaSHV、blaIMP-1、blaDHA-1)，氨基糖甙類(aadA1、aadA2、strA、strB、aadB、aacC2、aac(3)-IV、aphA1)，四環(huán)素類(tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(G))，喹諾酮類(gyrA、parC)和磺胺類(sul1、sul2、sul3)基因的引物，用于本菌株耐藥基因的檢測擴增。

1.7.2耐藥基因檢測 模板DNA的提取方法同上述1.4.2。用上述24對耐藥基因的引物進行擴增檢測。

反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq Mix 12.5 μL， 10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O 至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預變性5 min；95℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。取10 μL擴增產(chǎn)物電泳，紫外光下觀察結(jié)果，陽性產(chǎn)物測序。

2 結(jié)果

2.1 細菌形態(tài)分離菌株在TSA平板(含5%的新生牛血清)上，形成均一的表面光滑濕潤、邊緣整齊、圓形半透明、略帶藍色熒光的小菌落。挑取單個菌落革蘭染色鏡檢為革蘭陽性，菌體呈球形或卵圓形，呈單個、成對或短鏈存在(圖1)。

圖1 豬鏈球菌菌體形態(tài)(1 000×)

2.2 細菌純化鑒定及血清型檢測通過對采集的95份(腦組織30份、關(guān)節(jié)液36份、心血29份)疑似樣品進行細菌分離、純化、鑒定，共獲得豬鏈球菌68株其中腦組織24株(30份)，關(guān)節(jié)液22株(36份)，心血22株(29份)。

用29對豬鏈球菌血清型引物對68株豬鏈球菌進行血清型分型鑒定，結(jié)果分離菌株血清2型48株(腦組織18株、關(guān)節(jié)液12株、心血18株)，占70.5%；血清9型15株(腦組織6株、關(guān)節(jié)液7株、心血2株)，占22%；血清4型2株(關(guān)節(jié)液1株、心血1株)，占3%；血清14型2株(關(guān)節(jié)液2株)，占3%；血清3型1株(心血1株)，占1.5%(圖2，3)。

圖2 河南豬鏈球菌臨床分離株血清型分離鑒定統(tǒng)計結(jié)果

2.3 毒力基因檢測用3對毒力基因引物對68株豬鏈球菌分別行PCR擴增檢測，胞外因子(epf)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)和溶血素(sly)3個毒力基因目的條帶分別為626,885,1 502 bp(圖4)。結(jié)果分離菌株中毒力基因類型為epf-/mrp-/sly-有20株，分別是血清9型15株、血清14型2株、血清3型1株、血清2型2株；血清4型2株毒力基因類型均為epf-/mrp+/sly-；剩余46株血清2型中，毒力基因類型epf+/mrp+/sly+18株，epf+/mrp+/sly-3株，epf+/mrp-/sly+25株(表2)。

圖3 豬鏈球菌部分菌株血清型PCR鑒定結(jié)果 M．DL 2000 DNA Marker；1，3，5，7，9.豬鏈球菌通用引物鑒定；2.豬鏈球菌2型菌株； 4.血清3型菌株；6.血清4型菌株；8.血清9型菌株；10.血清14型菌株

表2 豬鏈球菌臨床分離株毒力基因類型檢測表

圖4 豬鏈球菌毒力基因PCR檢測結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2.epf毒力基因； 3.mrp毒力基因；4.sly毒力基因

2.4 藥敏試驗結(jié)果參照NCCLS手冊(2005版 )標準判定，68株豬鏈球菌臨床分離株藥敏試驗結(jié)果表明，河南省豬鏈球菌臨床分離株對不同種類的抗生素藥物的敏感性存在明顯差異(表3)。68株豬鏈球菌對β內(nèi)酰胺類抗生素敏感性結(jié)果較好，對頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林的敏感性分別為79.4%,75%,73.6%,70.6%，其中對頭孢噻呋、頭孢他啶2種藥物沒有發(fā)現(xiàn)臨床耐藥菌株，但青霉素的臨床敏感性不容樂觀，只有47.1%。68株豬鏈球菌對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、磺胺類藥物均表現(xiàn)出較高的臨床耐藥性，其中對四環(huán)素類藥物耐藥性最為突出，均在95%以上；對強力霉素、四環(huán)素、土霉素、卡那霉素沒有發(fā)現(xiàn)1株敏感菌株。此外，所有分離菌株均存在嚴重的多重耐藥現(xiàn)象，耐藥表型表現(xiàn)出均對5種或5種以上抗菌藥物耐藥現(xiàn)象。

表3 河南省豬鏈球菌臨床分離株藥物敏感試驗結(jié)果

2.5 耐藥基因檢測用24對耐藥基因引物對68株豬鏈球菌進行耐藥基因擴增檢測，結(jié)果共檢測出12種耐藥基因(圖5)，分別是blaTEM、aadA1、strA、strB、aadB、aacC2、aphA1、tet(B)、gyrA、parC、sul1和sul2基因，其中檢出率較高的耐藥基因分別是aphA1、tet(B)、gyrA和parC基因，檢出率分別是86%(59/68),89%(61/68),63%(43/68)和58%(40/68)。

圖5 豬鏈球菌個別菌株耐藥基因PCR檢測結(jié)果 M.DL 2000 DNA Marker；1.blaTEM；2.blaOXA-1；3.blaCTX-M-2；4.blaSHV；5.blaIMP-1；6.blaDHA-1；7.aadA1；8.aadA2；9.strA；10.strB；11.aadB；12.aacC2；13.aac(3)-IV；14.aphA1；15.tet(A)；16.tet(B)；17.tet(C)；18.tet(D)；19.tet(G)；20.gyrA；21.parC；22.sul1;23.sul2;24.sul3

3 討論

本試驗采集河南省不同規(guī)模豬場疑似豬鏈球菌病例的95份樣品，通過細菌分離、純化鑒定及血清型分型，共獲得68株豬鏈球菌，其中血清2型48株占70.5%，血清9型15株占22%，表明當前河南省豬鏈球菌流行優(yōu)勢菌株主要是血清2型，其次為血清9型，這與國內(nèi)其他報道較為一致[3,16]。此外，還從心血、關(guān)節(jié)液樣品中分離到2株4型菌株、2株14型菌株和1株3型菌株，并沒有分離到以往報道中占一定優(yōu)勢的血清1型和血清7型。表明臨床上豬鏈球菌流行優(yōu)勢菌株在不斷發(fā)生變化，因此，在生產(chǎn)實際中，選擇疫苗防控豬鏈球菌病，最好弄清區(qū)域內(nèi)優(yōu)勢血清型或者選擇使用含有血清2型的多價疫苗，確保獲得較為理想的防控效果。

豬鏈球菌菌株的致病性強弱與其攜帶的毒力基因密切相關(guān)，通常把胞外因子(epf)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、溶血素(sly)作為豬鏈球菌毒力指示蛋白,用來區(qū)分菌株的毒力強弱，epf+/mrp+/sly+常被認為與高致病性菌株相關(guān)[3,10]。本試驗通過對68株豬鏈球菌毒力基因檢測，共獲得5種毒力基因類型，epf+/mrp-/sly+毒力類型為25株，占比36.7%；其次為epf-/mrp-/sly-類型20株和epf+/mrp+/sly+18株。其中epf+/mrp-/sly+類型的25株和epf+/mrp+/sly+類型的18株均是血清2型菌株，而血清9型的15株毒力類型均是epf-/mrp-/sly-。結(jié)果表明河南省豬鏈球菌臨床流行菌株以epf+/mrp-/sly+毒力類型為主，其次是epf-/mrp-/sly-類型和epf+/mrp+/sly+類型，這一點與其他相關(guān)報道有一定的變化[10,17-18]。同時，通過菌株攜帶的毒力基因情況，表明臨床血清2型在致病性方面強于血清9型。

挑選6大類18種常用抗生素對68株豬鏈球菌進行藥敏試驗，結(jié)果顯示只有β內(nèi)酰胺類的頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林和氨芐西林敏感性較好，在70%以上；其中頭孢噻呋和頭孢他啶沒有發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。而對其他14中抗生素均表現(xiàn)出了高度的耐藥性，對四環(huán)素類的四環(huán)素、強力霉素、土霉素耐藥性最強，分別是100.0%,98.5%,98.5%；對氨基糖苷類的卡那霉素和阿米卡星的耐藥性也在95%以上；大環(huán)內(nèi)酯類的阿奇霉素和替米考星的耐藥性為88.1%,91.1%對喹諾酮類藥物的耐藥性在42%～58%，這與國內(nèi)的有關(guān)研究報道[19-20]基本一致。

對68株豬鏈球菌進行24種耐藥基因檢測，共檢測出12種耐藥基因。氨基糖苷類8種耐藥基因檢出6種，其中aphA1檢出率高達86%；喹諾酮類2種耐藥基因全部檢出，檢出率分別為63%,58%；四環(huán)素類5種耐藥基因檢出tet(B)1種，檢出率高達89%。結(jié)合表型耐藥結(jié)果，說明耐藥菌株耐藥基因的檢測結(jié)果和表型耐藥結(jié)果有很大的相關(guān)性。生產(chǎn)實際中，如何減少或消除耐藥細菌的耐藥基因，是減少耐藥菌株產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)，需要進一步進行深入研究和探索。

本試驗分離獲得的68株豬鏈球菌對大部分常用藥物表現(xiàn)出廣泛的耐藥現(xiàn)象，而且存在嚴重的多重耐藥性，且存在耐藥基因傳遞情況。筆者認為臨床菌株產(chǎn)生耐藥性的主要原因，主要是抗生素的長期濫用或不規(guī)范使用引起的。因此，在生產(chǎn)實際中，建議規(guī)?；i場在選擇疫苗或選藥、用藥前，最好通過有關(guān)機構(gòu)弄清本場流行菌株血清型和藥敏試驗篩選出敏感藥物，有的放矢，能很大程度上提高防控或治療效果。另外，如果能夠利用本場分離菌株制備相應(yīng)的疫苗，用于防控豬鏈球菌，無論從保護率方面還是在成本方面都是切實而有效的方法。