水稻P型ATP酶基因OsHMA功能分析與RNA干涉載體構(gòu)建

王 洋, 王瑩瑩, 張 政, 馮國(guó)棟, 周 宇, 牛向麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

水稻(Oryzasativa)作為當(dāng)今世界主要糧食作物之一,其產(chǎn)量會(huì)受到包括植物病蟲害、高低溫、旱澇、鹽堿及土壤重金屬等各種生物、非生物逆境脅迫的影響[1]。土壤作為植物賴以生存的根基,環(huán)境污染會(huì)引起土壤中某些重金屬離子的增加。伴隨著我國(guó)工業(yè)、城市污染的加劇以及農(nóng)用化合物種類、數(shù)量的增加,土壤重金屬污染程度、污染面積也不斷加劇。土壤中長(zhǎng)期積累存在的鋅、銅、鈷、鎘、鉻等金屬離子會(huì)對(duì)植物造成不同程度的損傷,致使植物代謝失衡,生物量、產(chǎn)量下降[2]。

P型ATP酶是一類廣泛存在于生物體內(nèi)、通過ATP的降解而驅(qū)動(dòng)的陽離子泵[3]。在植物體內(nèi),它們主要分布于質(zhì)膜上。P1B-ATPase(P1B型 ATPase)作為其中的一個(gè)亞族,具有高親和性吸收和泵出重金屬的功能。P1B-ATPase除了選擇性運(yùn)輸必需的金屬離子(Cu+、Cu2+、Zn2+、Co2+)外,還能轉(zhuǎn)運(yùn)一些重金屬離子(Cu2+、Cd2+和 Pb2+),因此 P1B-ATPase 又稱為重金屬 ATP 酶(heavy metal transporting ATPase,HMA)[4]。在擬南芥中有多個(gè)HMA基因,與鋅、銅離子的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān),該類基因的一些單基因突變體不會(huì)致死,但雙突變體則可能致死[5]。擬南芥基因組中有8個(gè)P1B亞族ATPase成員[6-7],其中AtHMA5在根和花中表達(dá)量明顯增高,負(fù)責(zé)將Cu+運(yùn)至胞外或特定器官[8]。

AtHMA7/RAN1可能位于高爾基膜泡上,將Cu+運(yùn)至乙烯受體ETR1,激活乙烯受體而產(chǎn)生乙烯響應(yīng),以及維持幼苗銅離子的平衡[9];AtHMA6/PAA1、AtHMA8/PAA2則被認(rèn)為分別位于根、葉的葉綠體外膜和類囊體膜上,負(fù)責(zé)將Cu+轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體基質(zhì)和類囊體腔[10-11]。水稻基因組中也有多個(gè)序列被推斷為HMA基因[12],但其具體功能尚未完全解析。有研究表明,OsHMA2參與Zn、Cd由根向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)[13];OsHMA3定位于水稻根細(xì)胞的液泡膜上,參與轉(zhuǎn)移Cd到液泡中[14];OsHMA9主要在水稻維管組織中表達(dá),包括木質(zhì)部、韌皮部,其基因敲除型突變體積累了更多的金屬離子,表明該基因?qū)τ谶@些金屬離子細(xì)胞外排起到了重要作用[15-16]。本研究對(duì)水稻2號(hào)染色體HMA基因(命名為OsHMA,基因登錄號(hào)AK107997)進(jìn)行了初步的功能分析以及RNA干涉載體構(gòu)建,為進(jìn)一步分析OsHMA基因在水稻金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)及抗土壤金屬離子脅迫中的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水稻粳稻品種日本晴(OryzasativaL. ssp.japonicacv. Nipponbare)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 質(zhì)粒和試劑

植物表達(dá)載體pHB由復(fù)旦大學(xué)楊洪全教授惠贈(zèng)；pSK載體、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存；DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)于TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TransGen公司；其余試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純；引物合成和測(cè)序由生工生物工程有限公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1OsHMA基因生物信息學(xué)分析

通過SMART在線程序 (http://smart.embl-heidelberg.de/) 對(duì)OsHMA編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析;通過亞細(xì)胞器蛋白定位軟件TargetP v1.01 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析OsHMA編碼蛋白的定位;利用植物調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/index.html)對(duì)OsHMA基因上游序列進(jìn)行分析。

1.3.2OsHMA基因表達(dá)模式分析

(1)OsHMA基因在水稻不同組織中的表達(dá)。取野生型日本晴幼苗(生長(zhǎng)21 d,28 ℃,12 h光/12 h暗)的根、莖、葉和田間成熟日本晴植株的根、莖、葉和穎花,加入液氮研磨后分別提取RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以水稻ACTIN為內(nèi)參基因(登錄號(hào)X16280),利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)分析OsHMA基因的表達(dá)情況。

OsHMA引物為:

5’-CTCGAGGATCCAGGCGGCTTGGTCTACCCCT-3’;

5’-AAGCTTAACTGCCAGCCGAATACGAT-3’。

ACTIN引物為:

5’-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC-3’;
5’-CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3’。

RT-PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

(2)OsHMA基因在金屬離子誘導(dǎo)水稻中的表達(dá)。野生型日本晴幼苗在光照培養(yǎng)箱中(28 ℃,12h光/12 h暗)生長(zhǎng)14 d后,以不同濃度金屬離子(1 mmol/L FeSO4、10 mmol/L FeSO4、1 μmol/L CuSO4、10 μmol/L CuSO4、7.5 mmol/L MgSO4、75 mmol/L MgSO4、1 μmol/L CoCl2、10 μmol/L CoCl2)分別誘導(dǎo)處理48 h。以蒸餾水處理組為對(duì)照,取各金屬離子處理組水稻幼葉,進(jìn)行RT-PCR,分析OsHMA基因的表達(dá)情況。具體實(shí)驗(yàn)方法、引物以及RT-PCR反應(yīng)條件如上所述。

1.3.3OsHMA基因RNA干涉載體構(gòu)建

從野生型日本晴水稻根中提取總RNA,然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。按照OsHMA基因序列(登錄號(hào)AK107997),選取OsHMA 3’端及非翻譯區(qū),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA做為模板進(jìn)行RNA干涉正向、反向片段的擴(kuò)增。

正向片段引物為:

CTCGAGGATCCAGGCGGCTTGGTCTACCCCT;
AAGCTTAACTGCCAGCCGAATACGAT。

兩端分別引入XhoⅠ、BamH Ⅰ與HindⅢ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。

反向片段引物為:

GAGCTCAGGCGGCTTGGTCTACCCCT;
GAATTCAACTGCCAGCCGAATACGAT。

兩端分別引入SacⅠ與EcoR Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。

將正向片段經(jīng)XhoⅠ、HindⅢ酶切回收后連接于pSK質(zhì)粒,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài),對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。反向片段經(jīng)SacⅠ與EcoR Ⅰ酶切回收,連接于上述已連接正向片段的pSK質(zhì)粒,從而形成正、反向重復(fù)基因片段。然后利用BamH Ⅰ與SacⅠ內(nèi)切酶將OsHMA正、反向重復(fù)基因片段插入植物表達(dá)載體pHB,構(gòu)建CaMV35S-OsHMARHAi載體,命名為pHB-HMARi。通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,獲得帶有pHB-HMARi質(zhì)粒的陽性農(nóng)桿菌克隆,保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 OsHMA基因生物信息學(xué)分析

通過SMART在線程序?qū)sHMA基因編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),結(jié)果表明,OsHMA有1個(gè)金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這一結(jié)構(gòu)域與玉米金屬結(jié)合蛋白、擬南芥銅分子伴侶約有30%的相似性。通過亞細(xì)胞器蛋白定位軟件TargetP v1.01 分析,顯示OsHMA編碼蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu),可能定位于根的成熟區(qū)。利用植物調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫PLACE對(duì)OsHMA基因上游序列的分析結(jié)果表明,編碼區(qū)上游2 000 bp有多種元件:7個(gè)銅應(yīng)答誘導(dǎo)序列元件GTAC(分別位于基因上游88、152、584、591、915、1 358、1 385 bp),2個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)VCGCGB(基因上游10、167 bp)、1個(gè)乙烯應(yīng)答元件AWTTCAAA(基因上游513 bp)以及7個(gè)黃化誘導(dǎo)表達(dá)元件ACGT,如圖1所示。

2.2 OsHMA基因表達(dá)模式

對(duì)OsHMA在水稻不同組織下的表達(dá)分析顯示:OsHMA在日本晴幼苗的根、莖中有表達(dá),在成熟植株根、莖、葉、穎花組織中均可以檢測(cè)到OsHMA基因的表達(dá)。但無論是在幼苗期還是在成熟期中,OsHMA基因在根中的表達(dá)水平明顯高于其他組織,如圖2所示。圖2中，1～7泳道分別為日本晴幼苗根、莖、葉和日本晴成熟植株根、莖、葉、穎花中OsHMA基因表達(dá)水平；ACTIN為內(nèi)參基因。

圖2 OsHMA基因在水稻不同組織中的表達(dá)

在日本晴幼苗葉片中未檢測(cè)到OsHMA基因的表達(dá),但經(jīng)過不同濃度金屬離子處理48 h后,RT-PCR分析結(jié)果表明,OsHMA可以受10 μmol/L Cu2+誘導(dǎo)表達(dá),如圖3所示。OsHMA基因的表達(dá)模式提示,它可能在水稻的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮功能。

圖3 OsHMA基因在不同金屬離子誘導(dǎo)條件下的表達(dá)

圖3中，1～9泳道分別為對(duì)照、1 mmol/L Fe2+、10 mmol/L Fe2+、1 μmol/L Cu2+、10 μmol/L Cu2+、7.5 mmol/L Mg2+、75 mmol/L Mg2+、1 μmol/L Co2+、10 μmol/L Co2+處理48 h水稻幼葉中OsHMA基因表達(dá)水平；ACTIN為內(nèi)參基因。

2.3 OsHMA基因RNA干涉載體構(gòu)建

帶有OsHMA基因正、反向重復(fù)基因片段RNA干涉載體pHB-HMARi的結(jié)構(gòu)如圖4所示。OsHMA基因RNA干涉片段RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖5a所示,從左至右依次為DNA Marker、正向基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物、反向基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物。OsHMA基因RNA干涉載體pHB-HMARi酶切電泳圖如圖5b所示,從左至右依次為:DNA Marker、正向片段BamH Ⅰ、HindⅢ酶切鑒定、反向片段SacⅠ 、EcoR Ⅰ酶切鑒定,及正、反向重復(fù)片段BamH Ⅰ、SacⅠ酶切鑒定。

圖4 pHB-HARi的結(jié)構(gòu)

從野生型日本晴根中提取總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA做為模板,進(jìn)行OsHMA基因 RNA干涉正向、反向片段的擴(kuò)增,如圖5a所示。將OsHMA基因正、反向重復(fù)基因片段經(jīng)中間載體pSK最終插入植物表達(dá)載體pHB,構(gòu)建RNA干涉載體pHB-HMARi,經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定,表明RNA干涉載體構(gòu)建完成,可用于后續(xù)水稻遺傳轉(zhuǎn)化,如圖5b所示。

圖5 OsHMA基因RNA干滲載體的構(gòu)建

3 討 論

植物的生長(zhǎng)除了碳、氫、氧等大量元素外,也需要微量的金屬元素,但隨著工礦業(yè)的迅速發(fā)展,以及化肥、農(nóng)藥的大量使用,導(dǎo)致土壤中金屬含量不斷累積,土壤金屬污染目前已經(jīng)成為全球性問題,我國(guó)做為工業(yè)迅速發(fā)展的發(fā)展中國(guó)家尤為嚴(yán)重。土壤中長(zhǎng)期積累存在的高濃度的鋅、銅、鈷等金屬離子會(huì)對(duì)作物造成不同程度損傷,致使其代謝紊亂,產(chǎn)量及品質(zhì)下降[17]。植物中存在的重金屬ATP酶(HMA)是一類與抗逆有關(guān)的重要蛋白,目前已被證明參與植物體內(nèi)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。水稻中也存在P型ATP酶[19],但其功能仍待系統(tǒng)研究。本工作對(duì)水稻的P型ATP酶基因OsHMA進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)OsHMA含有金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并且含有跨膜結(jié)構(gòu),表明OsHMA可分布于生物膜,通過分解ATP提供能量,結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子。通過對(duì)OsHMA基因的組織表達(dá)、誘導(dǎo)表達(dá)模式分析,也證實(shí)OsHMA基因在水稻根系中表達(dá)最高,并受銅離子誘導(dǎo),可能在水稻根系土壤中銅離子的轉(zhuǎn)運(yùn),以及抗銅離子脅迫中具有作用。

為深入探究水稻中OsHMA基因的功能,本研究進(jìn)一步選取OsHMA基因3’端及非翻譯區(qū)特異、低同源基因序列片段,構(gòu)建了RNA干涉載體,并將用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化與功能表型分析[20]。本工作對(duì)水稻OsHMA基因功能的探討,不僅有利于植物脅迫應(yīng)答分子機(jī)制的研究,也可進(jìn)一步將其作為目標(biāo)基因應(yīng)用于作物,提高作物的抗逆性和脅迫生長(zhǎng)環(huán)境中的產(chǎn)量,具有理論和應(yīng)用意義。