IGF2/H19印記基因與男性不育癥相關(guān)研究進(jìn)展*

王 福張愛民杜冠潮趙 豐郭 俊晏 斌** 綜述 郭 軍**審校

1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院（北京 100091）；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（陜西咸陽 712000）

基因印記(genomic imprinting)是一種不同于經(jīng)典孟得爾遺傳定律的現(xiàn)象,指體細(xì)胞來源于不同親代的一對(duì)等位基因發(fā)生的差異性表達(dá)；即機(jī)體僅表達(dá)來自親本其中一方的基因,另一方不表達(dá)或較少表達(dá)，因而只繼承母源或父源單方的遺傳屬性。如父源印記（paternal imprinting）是指父源等位基因不表達(dá)，僅僅母源基因表達(dá)，參與該遺傳特性的基因被稱為印記基因[1]。雖然此類基因在基因組中所占百分比較少，但其在生殖發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor-2，IGF2）和H19基因是其中具有代表性基因。兩者定位相近，相互印記，擁有同一調(diào)控系統(tǒng)，一起調(diào)控人體的生長發(fā)育。近年來，隨著科學(xué)研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)IGF2和H19的印記調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)IGF2和H19的印記異常與男性不育癥的發(fā)生有密切聯(lián)系[2，3]，本文就此類相關(guān)研究最新進(jìn)展綜述如下。

一、IGF2/H19基因簡介

IGF2為胚胎性生長因子，是分泌的小蛋白質(zhì)，是一種非常強(qiáng)的有絲分裂原，不受生長激素的調(diào)控；其調(diào)控諸多生理過程，可促進(jìn)多種細(xì)胞增殖和分化。IGF2基因定位于人體染色體11pl5.5，鼠體7號(hào)染色體遠(yuǎn)端，是最早發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性印記基因，屬于母源性印記基因，父方表達(dá)[4]。在小鼠IGF2基因敲除實(shí)驗(yàn)中，若敲除的等位基因來自母方，則小鼠的生長發(fā)育沒有明顯變化，若敲除的IGF2等位基因來自父方，則小鼠相對(duì)較小，生長發(fā)育受到限制[5]。一般來說，IGF2的表達(dá)常常在出生后受到抑制，出生后IGF2主要通過自分泌和旁分泌機(jī)制促進(jìn)局部組織的生長。

H19基因作為一種生長調(diào)節(jié)基因，在細(xì)胞的增殖和分化兩方面具有雙重作用，具有一定選擇表達(dá)，在人和鼠的胚胎組織中高度表達(dá)。這種現(xiàn)象體現(xiàn)在成人中主要表達(dá)部位是骨骼肌、心肌、乳腺等。H19基因位于人體11pl5.5，鼠體7號(hào)染色體遠(yuǎn)端，與IGF2基因相距僅70kb處，為一單拷貝基因，因其與IGF2基因的連鎖交互性而常放在一起進(jìn)行研究。與IGF2不同的是，H19基因?qū)俑冈葱杂∮浕颍冈幢磉_(dá)，其只在mRNA水平上發(fā)揮作用，最終的表達(dá)產(chǎn)物為RNA，不具備表達(dá)蛋白質(zhì)的功能[6]。但與IGF2相同的是，H19基因的表達(dá)也在機(jī)體出生后明顯受到抑制。

二、IGF2/H19基因印記機(jī)制

（一）增強(qiáng)子競爭學(xué)說

國外學(xué)者提出了增強(qiáng)子競爭學(xué)說[7]；該學(xué)說認(rèn)為IGF2/H19基因共享H19基因下游位置的增強(qiáng)子（Enhancer）；在父源染色體，H19上游的高度甲基化以及猜想中的染色體閉合結(jié)構(gòu)增強(qiáng)子不能作用于H19，使得IGF2激活進(jìn)而表達(dá)；在母源染色體上，由于增強(qiáng)子離H19較近，與H19的親和力更高，使得IGF2沉寂或極少表達(dá)，從而激活H19，使之得以表達(dá)（見圖1）。

該學(xué)說的主要貢獻(xiàn)是通過研究得出H19、IGF2共用一套增強(qiáng)子的結(jié)論，奠定了研究H19、IGF2的印記機(jī)制的理論基礎(chǔ)。但該學(xué)說也有一定的局限性，如對(duì)增強(qiáng)子如何選擇IGF2/H19基因的確切機(jī)制，并未做出具有高度說服力的解釋等。

圖1 IGF2/H19基因調(diào)控模式圖[8]

（二）CTCF絕緣子學(xué)說

根據(jù)增強(qiáng)子競爭理論，甲基化使父源H19及母源IGF2保持沉默。尚未明確指出母源IGF2啟動(dòng)子并未甲基化的原因，根據(jù)相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，位于H19上游2kb存在差異甲基化區(qū)域 (differentially methylated domain，DMD)。DMD即精子與卵子對(duì)同一基因具有不同程度的甲基化水平。這個(gè)區(qū)域有絕緣子(insulator)功能，甲基化控制絕緣子的活動(dòng)，而DNA甲基化是通過控制CTCF絕緣子蛋白(結(jié)合DMD的復(fù)合體)起作用的，這是研究H19和IGF2印記機(jī)制的突破性進(jìn)展。

對(duì)IGF2/H19基因而言，在父源等位基因上，H19上游及其啟動(dòng)子CpG島呈甲基化狀態(tài)；在母源等位基因上，呈現(xiàn)去甲基化狀態(tài)，未甲基化的DMD內(nèi)絕緣子序列可與CTCF結(jié)合形成絕緣子 (CTCF復(fù)合體)阻止IGF2基因與其下方增強(qiáng)子相互作用，結(jié)果只有H19基因表達(dá)。在父源染色體上，DMD內(nèi)CpG島甲基化導(dǎo)致無法與CTCF結(jié)合，從而H19基因下方增強(qiáng)子可以激活I(lǐng)GF2基因啟動(dòng)子，IGF2基因得以表達(dá)；與此同時(shí)由于H19啟動(dòng)子甲基化而保持不表達(dá)[9]?？梢姡珼MD在IGF2/H19的印記機(jī)制中起了最為關(guān)鍵的作用，有學(xué)者將此區(qū)域亦稱為DMR(differentially methylated region)或印記控制區(qū)(imprinting control region，ICR)[10,11]。

（三）其他學(xué)說

此外，部分學(xué)者還提出了關(guān)于IGF2/H19的印記機(jī)制的染色質(zhì)構(gòu)型學(xué)說、轉(zhuǎn)錄周期學(xué)說等相關(guān)學(xué)說[12，13]。

IGF2/H19基因位于同一印記區(qū)域，兩者緊密相連、相互印記。雖然增強(qiáng)子競爭學(xué)說及DMD共同調(diào)控印記基因IGF2/H19表達(dá)是目前較為認(rèn)同的主要學(xué)說，但仍未形成公認(rèn)。學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為IGF2/H19基因的調(diào)控機(jī)制絕不是單一因素的作用，而應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)。

三、IGF2/H19基因與男性不育癥

大量研究表明男性不育癥的發(fā)生與IGF2/H19基因表達(dá)密切相關(guān)。其主要方式是印記松馳(relaxation of imprinting,ROI)，即處于印記狀態(tài)的基因重新表達(dá)從而引起一系列的生理、病理改變，也有學(xué)者稱為印記丟失（loss of imprinting ，LOI）[14]。

（一）少精子癥

據(jù)Marques CJ等學(xué)者[15]研究發(fā)現(xiàn)，H19基因的異常甲基化對(duì)于男性不育癥的影響主要是影響精子的發(fā)生，導(dǎo)致少精子癥。對(duì)IGF2/H19基因上47個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化進(jìn)行檢測(cè)，精子濃度在20×106／mL以上的男性表現(xiàn)為正常的甲基化水平，其他男性不育癥患者呈現(xiàn)異常甲基化；而精子濃度低于10×106／mL的男性不育癥患者則表現(xiàn)為IGF2-DMD和H19-DMD位點(diǎn)甲基丟失嚴(yán)重；該研究表明，H19的異常甲基化與精子發(fā)生密切相關(guān)。國外另外一篇研究也得出類似的結(jié)論，該研究觀察了148名特發(fā)性男性不育癥患者以及33名精液正常的對(duì)照組IGF2/H19甲基化水平，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組IGF2/H19甲基化水平很高。[16]

國內(nèi)研究也可得出類似研究結(jié)果，李建波等[17]通過排除染色體核型分析和Y染色體微缺失等因素干擾，納入18例少精子癥患者(精子濃度＜15×106/mL，其余指標(biāo)均正常)、20例弱精子癥患者 (前向運(yùn)動(dòng)精子百分率＜32%，其余指標(biāo)均正常)，結(jié)果顯示與對(duì)照組（20例正常生育男性）甲基化丟失率[(0.30±0.06%]相比，少精子癥患者的H19印記控制區(qū)域的LOI顯著增加[(9.19±2.45)%]，甚至當(dāng)精子濃度＜3×106/mL時(shí)，差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。另外，有研究發(fā)現(xiàn)在無精子癥患者中，IGF2基因在睪丸組織中LOI高達(dá)52%[18]。

（二）弱精子癥

與IGF2/H19甲基化異常同精子發(fā)生異常密切相關(guān)的結(jié)論相比，其與弱精子癥的相關(guān)性存在爭議；董浩等[19]研究發(fā)現(xiàn)少精子癥和弱精子癥H19甲基化水平分別是［(75.04±15.35)%］、［(79.48±11.64)%］，均顯著低于正常對(duì)照組［(89.10±11.23)%］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；證實(shí)了IGF2/H19甲基化異常除了與少精子癥有關(guān)，與弱精子癥也有密切的聯(lián)系；但是李建波[17]的相關(guān)研究則提示弱精子癥患者H19印記控制區(qū)域的DNA甲基化丟失程度與對(duì)照組無顯著差異。

（三）畸形精子癥

畸形精子癥與IGF2/H19基因甲基化異常的相關(guān)性研究，目前也存在爭議。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)正常男性精液中的CpG島都呈現(xiàn)高甲基化水平，而在19個(gè)畸形精子癥患者中，11人在IGF2 DMR和H19 DMR中的多個(gè)CpG位點(diǎn)發(fā)生去甲基化，畸形精子癥患者H19表現(xiàn)出多個(gè)CpG島低甲基化，該研究證實(shí)畸形精子癥可能與IGF2/H19 ICR低甲基化有關(guān)[20]。然而董浩等[19]研究發(fā)現(xiàn)，畸形精子癥組中的印記基因H19甲基化水平(87.82±12.10)%與正常對(duì)照組(89.10±11.23)%的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上，弱精子癥、畸形精子癥與IGF2/H19的相關(guān)性存在爭議，可能跟弱精子癥、畸形精子癥檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)不一致，與樣本量、甲基化檢測(cè)方法、種族、地區(qū)等相關(guān)，弱精子癥、畸形精子癥與H19甲基化異常的相關(guān)性需要進(jìn)一步研究。

四、中醫(yī)藥干預(yù)IGF2/H19基因表達(dá)

隨著IGF2/H19基因與疾病的相關(guān)性受到醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注，其研究相關(guān)的思路與技術(shù)已逐漸應(yīng)用到中醫(yī)藥研究中。近年來，中醫(yī)藥研究主要集中在以下2個(gè)方面：（1）IGF2/H19基因甲基化程度的治療前后變化；（2）中醫(yī)藥治療對(duì)甲基化相關(guān)酶的影響。

中醫(yī)藥治療男性不育癥，特別是特發(fā)性不育癥方面，療效顯著，機(jī)制復(fù)雜[21,22]；但目前國內(nèi)已有學(xué)者關(guān)注中藥治療男性不育癥前后IGF2/H19基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，印記基因H19在腎陽虧虛證類患者的體內(nèi)表達(dá)出現(xiàn)異常，通過補(bǔ)益腎氣的方法予以治療可使H19的表達(dá)狀態(tài)得到明顯改善。臨床對(duì)比顯示，補(bǔ)腎中藥生精方治療腎陽虛患者3個(gè)月后，精子密度、（a+b）級(jí)精子均較治療前有明顯改善，且治療效果明顯優(yōu)于對(duì)照組；同時(shí)，患者的精子H19基因印記丟失率較治療前顯著降低，由 14.71%（5/34）降至 2.94%(1/34)；此類研究可證明補(bǔ)益腎氣中藥的作用機(jī)理與改善精子DNA印記基因H19表達(dá)具有相關(guān)性[23]。

五、討論

關(guān)于印記基因的DNA甲基化狀態(tài)與精液質(zhì)量關(guān)系的研究已然成為生殖領(lǐng)域的熱門研究方向[24]。IGF2和H19作為較早發(fā)現(xiàn)的此類基因代表，其印記異常與男性不育癥的發(fā)生以及患者病情的發(fā)展密切相關(guān)。因此，深入研究IGF2/H19基因印記與精子的發(fā)生、成熟之間的關(guān)系，可能會(huì)為男性不育癥的診斷提供新的思路；同時(shí)通過更深層次的研究印記基因的DNA甲基化機(jī)制，將為男性不育癥的發(fā)病機(jī)制研究和臨床治療提供新的發(fā)展方向。