血清miR-122 和miR-18a 作為HBV 相關(guān)肝病診斷標(biāo)志物的可行性研究

王遠(yuǎn)懿

（湖南師范大學(xué)附屬長(zhǎng)沙醫(yī)院，長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006）

肝病隨著現(xiàn)今人們生活質(zhì)量的提升而上升，尤其是針對(duì)一些慢性肝病患者，我國(guó)是慢性肝病大國(guó)，其病毒攜帶者已達(dá)1.2 億以上，而且呈不斷上升的趨勢(shì)，直接影響著人們的婚姻家庭、升學(xué)就業(yè)等方面的問(wèn)題，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了巨大的災(zāi)難，已成為影響人們生活質(zhì)量的重要疾?。?-2］。長(zhǎng)期的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是肝纖維化、肝硬化及肝癌的高危因素，嚴(yán)重威脅到患者的身體健康，且容易引發(fā)其他并發(fā)癥，臨床針對(duì)慢性肝病的診治高度重視，并加強(qiáng)研究與分析［3-4］。MicroRNA（miRNAs 微小PaqA）是一種單鏈非編碼RNA分子，廣泛存在于人類、動(dòng)物、植物的細(xì)胞中，其長(zhǎng)度約19～25nt，通過(guò)與靶基因序列特異性相互作用在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，作為一類新型基因調(diào)節(jié)劑與肝癌的關(guān)系相當(dāng)密切［5-6］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在肝癌組織中存在表達(dá)差異性，因此認(rèn)為檢測(cè)特定miRNA 表達(dá)譜的改變將有助于多種疾病的早期診斷，本研究探討血清miR-122 和miR-18a 作為HBV 相關(guān)肝病診斷標(biāo)志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究所納入的研究對(duì)象均經(jīng)過(guò)患者知情同意，對(duì)長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院2017 年8 月～2019 年8月收治的300 例HBV 相關(guān)肝病患者展開(kāi)對(duì)照研究，根據(jù)患者疾病類型分為HBV 相關(guān)肝硬化組、HBV 相關(guān)肝癌組及乙型肝炎組各100 例，另選取100 例健康體檢者作為對(duì)照組，經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均為我院2018 年2 月～2019 年2 月所收治，研究對(duì)象基線資料存在可比性，無(wú)明顯差異（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1 一般資料比較（n=100）

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）無(wú)其他重要臟器功能受損。（2）資料健全者。（3）所有患者均通過(guò)2016 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《肝病患者的診斷與治療標(biāo)準(zhǔn)》確診［7］。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）6 個(gè)月內(nèi)接受抗病毒及免疫調(diào)節(jié)治療的患者。（2）心、腦、腎及其它慢性病。（3）中途退出/轉(zhuǎn)院者。

1.2 方法

1.2.1 血液采集 采集研究對(duì)象5mL 晨起空腹外周靜脈血，置于室溫2 h 后予離心，標(biāo)本離心（3000 r/min，10min），取上清液分裝置于-80℃低溫冰箱凍存集中檢測(cè)。

1.2.2 RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄 利用德國(guó)Qiagen 公司的MicroMini Kit 試劑盒提取血清樣本中總RNA，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。并使用Nanodrop-1000（Thermo Scientific）紫外分光光度計(jì)測(cè)量其濃度。將200 ng 總RNA 樣本與5×miScript RT Buffer 4μL、miScriptReverse Transcriptase Mix 1μL、RT 引物1μL、dNTP 混合物0.5μL，RNA 酶抑制劑0.25μL 共同混合，最后用DEPC水補(bǔ)足20μL 制成混合液。將混合液置于以下培育條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37℃×60min，95℃×5min，后冷卻至4℃。并將最終cDNA 產(chǎn)物保存至-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR 通過(guò)SYBR Green 法，利用miScript SYBR Green PCR（Qiagen）試劑盒進(jìn)行real-time PCR 定量檢測(cè)microRNA，按如下體系操作：取1μL cDNA 樣品，混合12.5μL 2×QuantiTect SYBRGreen PCR Master Mix 溶液，1μL 10×miScript 通用引物溶液，1μL of 10×miScript 配對(duì)引物溶液，最后用9.5μL DEPC 水補(bǔ)足25μL 混合液。將7500Real-Time PCR 儀（Biosystems）設(shè)置擴(kuò)增條件：95℃×10min，然后將95℃×15s、56℃×30s，72℃×35s 過(guò)程進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，最終將產(chǎn)物放置于-20℃保存。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。

1.3 觀察指標(biāo) 比較不同研究對(duì)象的血清miR-122 和miR-18a 差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本文研究中選擇SPSS 18.0 系統(tǒng)計(jì)算數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料與計(jì)量資料分別采用F 檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)差異以P 值是否小于0.05 進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

2.1 不同研究對(duì)象血清miR-122、miR-18a 表達(dá)差異

與對(duì)照組miR-122 相比，HBV 相關(guān)肝硬化組、HBV相關(guān)肝癌組、乙型肝炎組中表達(dá)下調(diào)，存在顯著差異（P<0.05），與對(duì)照組miR-18a 相比，HBV 相關(guān)肝硬化組、HBV 相關(guān)肝癌組、乙型肝炎組中表達(dá)上調(diào)，存在顯著差異（P<0.05），參考表2。

表2 不同研究對(duì)象血清miR-122、miR-18a表達(dá)差異

2.2 血清miR-122、miR-18a 診斷的敏感性與特異性

應(yīng)用ROC 曲線及曲線下面積（AUG）評(píng)估m(xù)iR-122、miR-18a 的診斷價(jià)值，miR-122 敏感性、特異性分別為73.00%、70.00%，miR-18a 為83.00%、60.00%，見(jiàn)表3。

表3 血清miR-122、miR-18a診斷的敏感性與特異性

3 討論

我國(guó)是乙肝感染的高發(fā)區(qū)，肝硬化患者的數(shù)量逐年增多。為提高肝硬化患者的生存期，改善其生活質(zhì)量，降低其癌變率及死亡率，肝硬化的早診早治顯得尤為重要［8］。

腫瘤標(biāo)志物一類由腫瘤細(xì)胞異常代謝或是宿主對(duì)腫瘤的刺激反應(yīng)而產(chǎn)生，分泌或脫落到體液或組織液中，能夠較為準(zhǔn)確地反映腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化階段和進(jìn)展特性，與腫瘤發(fā)展具有較大關(guān)系。腫瘤標(biāo)志物的產(chǎn)生受到體內(nèi)多種因素的影響，與腫瘤的類型、良惡性、發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在部分正常組織和良性病變的情況下也可能有極少量表達(dá)，但在腫瘤組織中含量極大增高。它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞功能，以幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)。因?yàn)槟[瘤標(biāo)志物存在于腫瘤患者的組織、體液和排泄物中，因此能夠通過(guò)免疫學(xué)、生物學(xué)及化學(xué)的方法檢測(cè)到。miRNA（microRNA）是一類長(zhǎng)度約18～25nt 的內(nèi)源性非編碼小RNA，由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度約70～80nt 的單鏈RNA 前體（pre-miRNA）剪切后生成［9-10］。在人體內(nèi)，它通過(guò)與靶基因mRNA 分子3’UTR 區(qū)結(jié)合，抑制靶基因的翻譯，負(fù)調(diào)控靶基因的蛋白水平。研究表明它在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、血管形成、腫瘤發(fā)生等許多重要病理生理過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用［11-12］。在腫瘤方面，研究發(fā)現(xiàn)miRNA 與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成、浸潤(rùn)甚至治療耐受等有密切關(guān)系［13］。近年來(lái)，眾多研究表明miRNA 與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，由于相關(guān)的靶基因?qū)δ[瘤的作用不同，不同miRNA 在腫瘤中表達(dá)情況也存在差異，因而可以根據(jù)這種表達(dá)差異來(lái)判斷miRNA對(duì)腫瘤的調(diào)控作用［14-15］。本研究選取了miR-122 和miR-18a 對(duì)HBV 相關(guān)肝臟疾病進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，與對(duì)照組miR-122 相比，HBV 相關(guān)肝硬化組、HBV相關(guān)肝癌組、乙型肝炎組中表達(dá)下調(diào)，存在顯著差異，與對(duì)照組miR-18a 相比，HBV 相關(guān)肝硬化組、HBV 相關(guān)肝癌組、乙型肝炎組中表達(dá)上調(diào)，存在顯著差異，應(yīng)用ROC 曲線及曲線下面積（AUG）評(píng)估m(xù)iR-122、miR-18a 的診斷價(jià)值，miR-122 敏感性、特異性分別為73.00%、70.00%，miR-18a 為83.00%、60.00%。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 的異常表達(dá)分抑癌性miRNA 與原癌性miRNA 兩類：前者在正常組織中高表達(dá)，在癌性組織中低表達(dá)，后者則反之。本研究結(jié)果表明，miR-18a 作為癌性miRNA，miR-122 作為抑癌性miRNA 參與了肝病的進(jìn)展，在先前的miRNA 在乙型肝炎的研究中，通過(guò)Western blot 及免疫熒光等方法證實(shí)上述結(jié)論，表明miR-122 參與乙型病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，可能原因在于患者出現(xiàn)HBV 相關(guān)肝病后，其正常肝細(xì)胞數(shù)量減少或功能下降，肝臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，引起微循環(huán)障礙，從而導(dǎo)致肝臟對(duì)抗原的處理能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致miR-122 表達(dá)下調(diào)，miR-18a 表達(dá)上調(diào)，或者低水平的miR-122、高水平的miR-18a 使其抗肝纖維作用減弱，從而導(dǎo)致肝病的進(jìn)一步進(jìn)展。

綜上所述，miR-18a 在HBV 相關(guān)肝病血清中表達(dá)上調(diào)，miR-122 表達(dá)下調(diào)，兩者對(duì)HBV 相關(guān)肝病的診斷具有潛在價(jià)值，此方法可廣泛應(yīng)用于臨床。