免疫治療在宮頸癌中的作用機(jī)制及對PD-1/PD-L1 信號通路的影響研究

孫曉華

（河北省秦皇島市婦幼保健院婦二科，秦皇島 066000）

宮頸癌作為一種婦科常見的惡性腫瘤，通常發(fā)生于宮頸陰道、宮頸管內(nèi)柱狀上皮細(xì)胞和移行帶鱗狀上皮細(xì)胞的交界處［1-2］。在宮頸癌病情的發(fā)生、發(fā)展過程中，人乳頭瘤病毒（HPV）扮演著極為重要的角色，高危型的HPV 持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸粘膜細(xì)胞出現(xiàn)免疫障礙，是誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的主要機(jī)制［3］。一般情況下，異型細(xì)胞能夠被免疫系統(tǒng)準(zhǔn)確識別和消滅，但腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)和分泌某些膜因子、可溶性細(xì)胞因子或修飾自身表明抗原，使腫瘤組織的微環(huán)境發(fā)生改變，形成免疫耐受區(qū)域，或使T 細(xì)胞不能發(fā)揮正常功能，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸［4］。免疫系統(tǒng)在腫瘤的形成階段及腫瘤的持續(xù)狀態(tài)上都發(fā)揮重要作用。

程序性死亡蛋白1（PD-1）屬于免疫抑制受體，能夠通過與其配體程序性死亡配體1（PD-L1）結(jié)合［5］，負(fù)性調(diào)控T 細(xì)胞的活化、增殖并誘導(dǎo)其凋亡。PD-1/PD-L1信號通路的激活導(dǎo)致腫瘤特異性T 細(xì)胞不能被活化，機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答受到抑制，從而使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷［6］。因此，通過藥物阻斷該通路則能夠顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫功能，促進(jìn)有效和持久的宿主腫瘤免疫力的發(fā)生，從而抑制腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。本研究在放療的基礎(chǔ)上聯(lián)合采用抗PD-1/PD-L1 免疫療法進(jìn)行治療，同時對其作用機(jī)制及對PD-1/PD-L1 信號通路進(jìn)行探討，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017 年12 月～2019 年1 月在我院進(jìn)行治療的97 例宮頸癌患者的臨床病歷資料進(jìn)行回顧性分析，所有患者均經(jīng)宮頸刮片細(xì)胞學(xué)和病理學(xué)明確證實(shí)為宮頸癌，F(xiàn)IGO 分期在Ⅰb～Ⅳ期，KPS 評分均在60 分以上，預(yù)計生存期均大于3 個月，入院治療前均為接受任何放療、化療等治療。同時排除了伴有心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、全身感染、嚴(yán)重器質(zhì)性病變者以及有免疫抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素等藥物服用史者。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者詳細(xì)知情并簽署知情同意書。

按照治療方案的不同將其分為觀察組（41 例）和對照組（56 例），觀察組患者的年齡在31～64 歲之間，平均年齡為（48.46±5.19）歲，病程在2～7 年之間，平均病程為（4.67±1.13）年，病理分期：Ⅰb 期11 例、Ⅱ期14 例、Ⅲ期9 例、Ⅳ期7 例；對照組患者年齡29～65 歲，平均年齡為（48.46±5.19）歲，病程2～7 年，平均（4.67±1.13）年，病理分期：Ⅰb 期17 例、Ⅱ期20 例、Ⅲ期11 例、Ⅳ期8例。兩組患者的一般資料比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 治療方法 兩組患者均采取放射療法進(jìn)行治療，外照射量控制在180～200Gy，內(nèi)照射劑量以A（位于穹隆上2cm，子宮中軸外2cm）、B（與A 點(diǎn)同一水平，再向外3cm）兩點(diǎn)為參考。A 點(diǎn)劑量總值為25～36Gy，B 點(diǎn)總劑量為40～50Gy。根據(jù)宮頸癌患者的病理分期不同分別調(diào)整放射治療的具體劑量和頻率：Ⅰb 期：照射盆腔四野，4～4.5 周進(jìn)行一次，40～50Gy/次；Ⅱ期：4.5～5 周一次，40～50Gy/次；Ⅲ、Ⅳ期：5～6 周一次，45～60Gy/次。

觀察組患者在放療治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合抗PD-1/PD-L1 免疫療法進(jìn)行治療。重癥病情者于1 個月后開展2 次療程，其他患者于3 個月后開展2 次療程。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 臨床治療效果 參照國際抗癌聯(lián)盟的相關(guān)療效標(biāo)準(zhǔn)［7］對宮頸癌患者的臨床治療效果進(jìn)行對比性分析：（1）完全緩解（CR）：經(jīng)影像學(xué)檢查現(xiàn)有病灶消失，無新病灶出現(xiàn)，治療前存在的與疾病相關(guān)的癥狀消失和生化指標(biāo)（如LDH）均恢復(fù)正常；（2）部分緩解（PR）：腫瘤體積減少＞50%，未見新病灶；（3）穩(wěn)定（SD）：腫瘤體積縮減≤50%；（4）進(jìn)展（PD）：腫瘤體積未見明顯變化或擴(kuò)散，有新病灶出現(xiàn)?？傆行?（CR+PR）/總例數(shù) ×100%。

1.3.2 外周血PD-1、PD-L1 陽性表達(dá)及外周血T 淋巴細(xì)胞亞群表達(dá) 儀器及試劑：流式細(xì)胞儀，溶血劑（美國Beckman Coulter EPICS XL）；熒光抗體包括PECy5 標(biāo)記人CD3 單抗、PE 標(biāo)記人PD-1 單抗，PE 標(biāo)記人PD-L1 單抗、PE 標(biāo)記人IgG Ⅰ同型對照抗體，抗體均由美國EB 公司提供。

于治療前、治療后1 周采集兩組患者的EDTA-K2抗凝靜脈血6mL，取3mL 送檢制備CD3+ PD-1+ T 細(xì)胞、CD3+ PD-L1+ T 細(xì)胞，具體步驟如下：取兩份50μL全血分別加入5μL CD3 抗體、5μL PD-1 抗體和5μL CD3 抗體、+5μL PD-L1 抗體，分別混合均勻后在常溫避光環(huán)境下靜置30min，之后再加入250μL 溶血劑混勻并靜置12min，接著分別加入1mL 流式細(xì)胞儀鞘液進(jìn)行離心處理（1500r/min，3min），離心后去其上清液，加入500μL 鞘液重懸細(xì)胞后于3h 內(nèi)上機(jī)檢測。

每次檢測均設(shè)立空白對照和同型對照，以SSCFS 設(shè)門，分別取10000 個淋巴細(xì)胞計數(shù)，觀察CD3+ PD-1+ T、CD3+ PD-L1+ T 細(xì)胞的表達(dá)情況，計算CD3+ PD-1+ T 細(xì)胞、CD3+ PD-L1+ T 占淋巴細(xì)胞比例，結(jié)果以陽性率（%）的形式表示。

另將治療前、治療后1 周采集的3mL 靜脈血送檢，采用流式細(xì)胞儀對血液樣本中的血漿T 淋巴亞群水平（CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+）進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究選擇SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對各項(xiàng)數(shù)據(jù)資料分析、處理，計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，計數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)的形式表示，數(shù)據(jù)比較分別數(shù)據(jù)采用雙側(cè)t 檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)進(jìn)行，P<0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的臨床治療效果 觀察組患者的總有效率為65.85%，明顯高于對照組（42.86%），差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 兩組患者的臨床治療效果比較［n（%）］

2.2 治療前后兩組患者的外周血PD-1、PD-L1 水平

治療前，兩組患者的外周血PD-1、PD-L1 水平比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），治療后，兩組患者的PD-1、PD-L1 水平均明顯低于治療前，觀察組患者的PD-1、PD-L1 水平均明顯低于同期對照組（P<0.05），見表2。

表2 治療前后兩組患者外周血的PD-1、PD-L1水平比較（%）

2.3 治療前后兩組患者的外周血T 淋巴細(xì)胞亞群變化 治療前，兩組患者的CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；治療后，觀察組患者的CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平均明顯高于治療前，且同時明顯高于高于同期對照組，差異比較統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 治療前后宮頸癌患者的外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平變化

3 討論

宮頸局部微環(huán)境中免疫功能下降以及免疫逃逸現(xiàn)象是促使宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素。腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡及無反應(yīng)性是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸現(xiàn)象發(fā)生的主要機(jī)制［8-9］，協(xié)同刺激因子及其他相應(yīng)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與了這一過程。

PD-1 是免疫球蛋白B7-CD28 家族成員之一，在許多腫瘤組織中的淋巴細(xì)胞中，尤其是T 淋巴細(xì)胞中均可檢出其表達(dá)［10］。PD-L1 是PD-1 的主要配體，通常表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面。一般情況下，組織細(xì)胞表面的PD-L1 和淋巴細(xì)胞表面的PD-1 結(jié)合后，PD-1/PD-L1信號通道得以激活［11-12］，可抑制淋巴細(xì)胞功能，誘導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞凋亡，能夠在最大程度上減少免疫反應(yīng)對正常組織的損傷，避免自身免疫疾病的發(fā)生。然而，激活PD-1/PD-L1 信號通道能夠使T 細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞因子分泌受到抑制［13］，免疫效能明顯下降，負(fù)性調(diào)控機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答功能，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)局部進(jìn)展和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。

PD-1、PD-L1 信號通路不僅能夠使中路逃脫機(jī)體免疫殺傷，同時在抵抗免疫治療過程中也發(fā)揮重要作用［14］。隨著對腫瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤逃逸機(jī)制的深入研究，采用單克隆抗體及相關(guān)藥物阻斷PD-1、PD-L1信號通路已成為一種新的腫瘤治療手段［15］，在非小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌等多種類型腫瘤的治療過程中均表現(xiàn)出顯著療效。而近年來較多的臨床基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)，抗PD-1、抗PD-L1 抗體等免疫檢查點(diǎn)阻滯劑在阻斷PD-1/PD-L1 信號通路上效果明顯［16］。在小鼠模型中，抗PD-1 抗體可阻斷PD-1/PD-L1 信號通路，降低促癌細(xì)胞因子的表達(dá)，T 細(xì)胞免疫功能和機(jī)體免疫應(yīng)答得到顯著增強(qiáng)，腫瘤免疫微環(huán)境得到重塑［17］。

本研究結(jié)果顯示，接受免疫治療的患者的總有效率為65.85%，明顯高于未接受免疫治療的患者（42.86%）。另外，行免疫治療的患者在治療后的外周血PD-1、PD-L1 水平明顯低于治療前，且同時低于同期未接受免疫治療者。接受免疫治療的患者的CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平均明顯高于治療前，且同時明顯高于高于同期對照組。這一結(jié)果說明，宮頸癌患者體內(nèi)存在PD-1/PD-L1 所介導(dǎo)的負(fù)性共刺激過度激活的現(xiàn)象。經(jīng)抗PD-1/PD-L1 免疫療法治療后，PD-1/PD-L1 信號通道過度激活得到有效緩解，機(jī)體免疫功能得到顯著提升。

可見，宮頸癌患者存在PD-1、PD-L 異常表達(dá)，PD-1/PD-L1 信號通道被激活，機(jī)體抗腫瘤免疫功能下降。抗PD-1/PD-L1 免疫療法能夠有效阻斷PD-1/PD-L1 信號通路，顯著增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能，使腫瘤細(xì)胞無法逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷?？筆D-1/PD-L1 免疫療法是臨床治療宮頸癌的新策略，介于本研究納入樣本較少，免疫治療在治療宮頸癌上的臨床療效仍需大量的研究來進(jìn)一步證實(shí)。