化瘀通絡(luò)灸對(duì)VD大鼠體外干預(yù)HUVEC-12細(xì)胞VEGF、bFGF蛋白表達(dá)的影響

張曼 陸定其 吳偉偉 楊駿

[摘要] 目的 觀(guān)察化瘀通絡(luò)灸對(duì)VD大鼠血清體外干預(yù)HUVEC-12細(xì)胞VEGF、bFGF蛋白表達(dá)的影響。 方法 采用四血管阻斷法制造VD大鼠模型，隨機(jī)分為艾灸組、模型組、西藥組，另設(shè)假模型組作為對(duì)照，艾灸組采用化瘀通絡(luò)灸法，取百會(huì)、神庭、大椎艾灸，西藥組茴拉西坦灌胃，每日一次，治療2個(gè)療程，采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。取艾灸組、模型組、假模型組VD大鼠的血清體外培養(yǎng)HUVEC-12細(xì)胞，另設(shè)平行培養(yǎng)液組作為對(duì)照，采用Western blot法檢測(cè)各組VEGF、bFGF的蛋白表達(dá)。 結(jié)果 治療結(jié)束后，與模型組潛伏期為（36.25±10.71）s、錯(cuò)誤次數(shù)為（6.19±0.74）次、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為（3.00±0.53）分比較，艾灸組和西藥組的潛伏期為（232.31±22.25）s和（201.38±13.12）s，均延長(zhǎng)（P<0.01）;錯(cuò)誤次數(shù)為（1.00±0.56）次和（2.53±0.84）次及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為（1.00±0.56）分和（1.74±0.47）分，均降低（P<0.01）。艾灸組和西藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組、假模型組、平行液組比較，艾灸組的HUVEC-12細(xì)胞VEGF、bFGF的蛋白表達(dá)水平（0.84±0.09）和（0.87±0.05）較高，有顯著差異（P<0.01）。 結(jié)論 化瘀通絡(luò)灸法能夠明顯提高VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，增強(qiáng)HUVEC-12的VEGF、bFGF的蛋白表達(dá)，其治療VD可能與其促血管生成作用相關(guān)，為針灸治療VD提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 血管性癡呆;化瘀通絡(luò)灸;血管生成;VEGF;bFGF

[中圖分類(lèi)號(hào)] R245? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）33-0033-05

[Abstract] Objective To observe the effect of Huayu Tongluo Moxibustion on the expression of VEGF and bFGF protein in HUVEC-12 cells of VD rats in vitro. Methods The four-vessel blocking method was used to make VD rat models， and they were randomly divided into the moxibustion group， model group， and western medicine group. Another fake model group was set up as the control group. The moxibustion group was treated with moxibustion for removing blood stasis and dredging collateral， taking Baihui and Shenting， Dazhui for moxibustion. The western medicine group was given aniracetam lavage once a day for two courses of treatment. The platform jumping experiment was used to detect the neurobehavioral score of each group. HUVEC-12 cells were cultured in vitro from the serum of VD rats in the moxibustion group， the model group， and the sham model group， and the parallel solution group was also set up as the control group. Western blot was used to detect the protein expression of VEGF and bFGF in each group. Results After treatment， compared with the model group's incubation period was（36.25±10.71） seconds， the number of errors was（6.19±0.74）times， and neurobehavioral score was（3.00±0.53） points， the incubation period of the moxibustion group and the western medicine group was（232.31±22.25） seconds and（201.38±13.12） seconds were prolonged（P<0.01）; The number of errors was（1.00±0.56） times and（2.53±0.84） times and neurobehavioral scores was（1.00±0.56）points and（1.74±0.47）points were decreased（P<0.01）. The difference between the moxibustion and western medicine groups was statistically significant（P<0.05）. Compared with those of the model group， sham model group， and parallel solution group， the protein expression levels of VEGF and bFGF in HUVEC-12 cells in the moxibustion group（[0.84±0.09] and [0.87±0.05] ） were higher， with significant differences（P<0.01）. Conclusion Huayu Tongluo Moxibustion can significantly improve the learning and memory ability of VD rats， and enhance the protein expression of VEGF and bFGF of HUVEC-12. Its treatment of VD may be related to its pro-angiogenesis effect， which provides a theoretical basis for VD's acupuncture treatment.

[Key words] Vascular dementia; Huayu Tongluo Moxibustion; Angiogenesis; VEGF; bFGF

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）多由腦血管疾病引起認(rèn)知功能障礙[1]。隨著我國(guó)人口老齡化的不斷增加，VD的發(fā)病率隨年齡逐漸增加，80～89歲為4.09%，90歲以上為6.10%[2]，是目前影響中老年人健康和生活質(zhì)量的常見(jiàn)病、多發(fā)病。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)其可能與大腦皮層、海馬的病變有關(guān)[3]。近年來(lái)針灸治療VD臨床及實(shí)驗(yàn)研究均取得較好的進(jìn)展[4-6]，尤其是“化瘀通絡(luò)灸法”的運(yùn)用。在腦缺血后的血管新生過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growth factor， bFGF）發(fā)揮重要作用[7]。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）作為血管內(nèi)皮細(xì)胞研究較為穩(wěn)定，可作為干預(yù)的觀(guān)察對(duì)象。實(shí)驗(yàn)先行HUVEC細(xì)胞株的復(fù)蘇和傳代，然后經(jīng)艾灸治療的動(dòng)物血清干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）培養(yǎng)。本研究觀(guān)察化瘀通絡(luò)灸對(duì)VD大鼠體外干預(yù)HUVEC-12細(xì)胞VEGF、bFGF蛋白表達(dá)的影響，探討其治療血管性癡呆可能的有效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥物

清艾條（Φ10 mm×100 mm，由安徽省天長(zhǎng)市壽民灸具廠(chǎng)提供），茴拉西坦膠囊（0.1 g×30片/瓶，無(wú)錫市凱西藥業(yè)有限公司，批號(hào) 20090112），TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），DTT-2 大鼠跳臺(tái)儀（由北京中國(guó)中醫(yī)科學(xué)研究院提供），電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（美國(guó)pierce公司），PRMI-1640培養(yǎng)液（GIBCO公司），EDTA（Hyclone公司），一抗兔抗人VEGF、一抗兔抗人bFGF、二抗羊抗兔IgG抗體（合肥泓杉生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，每只（250±50）g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SCXK（蘇）2008-0004。假模型組8只由電腦隨機(jī)數(shù)字法得出，其余大鼠復(fù)制血管性癡呆的模型，跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)篩選出合格癡呆大鼠24只，并隨機(jī)分為艾灸組、西藥組和模型組，每組8只。

1.3 造模[8]

四血管阻斷法復(fù)制VD大鼠模型。假模型組保留雙側(cè)頸總動(dòng)脈不予阻斷。術(shù)后手術(shù)部位施以適量青霉素對(duì)抗感染，常規(guī)飼養(yǎng)。通過(guò)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)篩選出符合條件的大鼠。將 2只大鼠放于2間內(nèi)，適應(yīng)3 min后通以40 V的交流電5 min。然后將其置于絕緣體平臺(tái)后開(kāi)始計(jì)時(shí)，第一次跳到銅柵上的時(shí)間作為潛伏期，5 min內(nèi)跳下銅柵再跳回到平臺(tái)的次數(shù)記錄為錯(cuò)誤次數(shù)，兩者作為大鼠行為學(xué)記憶成績(jī)。假模型組和已造模組大鼠在模型復(fù)制后4 d進(jìn)行初次神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，艾灸組和西藥組于第二療程治療結(jié)束后6 h再次進(jìn)行評(píng)分;模型組和假模型組平行進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。按照改進(jìn)的Longa[9]的5級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分1～4分納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 方法

艾灸組采用化瘀通絡(luò)灸法治療，具體的操作方法是將大鼠固定于鼠板上，百會(huì)穴、神庭穴、大椎穴處剃毛參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖點(diǎn)穴[10]。百會(huì)：頂骨正中;神庭：在額頂骨縫交界線(xiàn)前方;大椎：第7頸椎與第1胸椎之間。百會(huì)穴隔附子餅壓灸，用附子粉、黃酒制成直徑約15 mm、厚約5 mm附子餅，中間用針刺10個(gè)小孔。點(diǎn)燃清艾條在附子餅上壓灸，皮膚灼熱潮紅時(shí)立即提起，旋即再壓灸，共20 min，大椎穴和神庭穴懸起灸20 min。每天1次，15 d為1個(gè)療程 ，共治療2個(gè)療程。西藥組將茴拉西坦與蒸餾水混合成0.01 g/mL濃度的溶液灌胃，每千克大鼠茴拉西坦0.0625 g，療程與艾灸組平行。模型組與假模型組鼠板固定后不做治療，時(shí)間上與艾灸組相平行。

1.5 血清制備

艾灸組大鼠在每個(gè)療程結(jié)束后，在目?jī)?nèi)眥取血2 mL，以3000 r/min離心15 min，然后同組的血清混合，56℃、30 min進(jìn)行滅活，0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?模型組和假模型組制備血清的方法與艾灸組相同，西藥組不制備。

1.6 HUVEC-12培養(yǎng)、分組及血清干預(yù)

1.6.1 復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)? 將HUVEC-12細(xì)胞株置于40℃溫水中搖晃，移至離心管，加入含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及5%100 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI-1640的培養(yǎng)基中，稀釋5倍，混勻，以1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)液反復(fù)吹打混勻，5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，出現(xiàn)80%融合狀態(tài)時(shí)，以0.25%胰酶溶液消化傳代。

1.6.2 種板? 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入胰酶2 mL消化30 s～1 min后，棄去胰酶，加入全細(xì)胞培養(yǎng)液3 mL，吹打細(xì)胞使之脫落為單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按每孔105個(gè)細(xì)胞的密度接種于12孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞使其達(dá)到80%的密度。

1.6.3 分組及血清干預(yù)? 實(shí)驗(yàn)HUVEC-12分為四組，艾灸組配制含10%艾灸組大鼠血清的RPMI-1640;模型組和假模型組分別配制含10%模型組與假模型組大鼠血清;平行培養(yǎng)液組配制含10%胎牛血清。取貼壁生長(zhǎng)的單層細(xì)胞，換用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，更換不同的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.7 Western blot法檢測(cè)各組HUVEC-12細(xì)胞VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)

PBS清洗細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液100 μL提取總蛋白，以BCA法檢測(cè)上清液中蛋白濃度，按1∶1加入1×上樣緩沖液。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入Western封閉液，室溫封閉2 h。加入一抗（VEGF、bFGF、Beta-actin抗體）4℃孵育過(guò)夜，清洗后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，將漂洗過(guò)的濾膜在雙蒸水中平衡5 min。取1 mL A、B液等比例混合底物，將發(fā)光劑和增強(qiáng)劑均勻的涂抹徹底覆蓋薄膜，避光處理5 min棄去表面液體。最后采用X膠片顯影。結(jié)果采用Quantity one 灰度分析軟件分析圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊采用t'檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用方差分析，其中兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模4 d VD大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

見(jiàn)表1。造模組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均大于1，平均（2.45±0.76）分，表明造模成功。與假模型組比較，造模組大鼠的潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)經(jīng)t（t'）檢驗(yàn)均有顯著性差異（P<0.01，P<0.01），造模組大鼠的潛伏期顯著短于假模型組，錯(cuò)誤次數(shù)顯著多于假模型組，表明VD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)顯著低下。

2.2 治療后各組VD大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

見(jiàn)表2。與模型組比較，艾灸組、西藥組潛伏期較長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與西藥組比較，艾灸組潛伏期較長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以上數(shù)據(jù)表明化瘀通絡(luò)艾灸組和西藥組均可以提高VD大鼠潛伏期，降低了VD大鼠錯(cuò)誤次數(shù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，且艾灸組的療效更顯著。

2.3 Western blot法檢測(cè)艾灸效應(yīng)血清干預(yù)HUVEC-12的VEGF、bFGF蛋白表達(dá)水平

HUVEC-12細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)封三圖2。四組HUVEC-12細(xì)胞間VEGF、bFGF的蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果均有差異（P<0.01或P<0.05），見(jiàn)表3、圖1。與模型組、假模型組、平行培養(yǎng)液組比較，艾灸組的HUVEC-12細(xì)胞VEGF、bFGF的蛋白表達(dá)具有顯著性差異（P<0.01）。與假模型組比較，模型組VEGF、bFGF的蛋白表達(dá)有差異（P<0.05）。結(jié)合神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，說(shuō)明兩個(gè)療程治療后，化瘀通絡(luò)灸法組大鼠艾灸效應(yīng)血清對(duì)HUVEC-12細(xì)胞VEGF、bFGF的蛋白表達(dá)水平較高，具有臨床意義。

3 討論

《靈樞經(jīng)·海論》有“腦為髓之?！韬２蛔悖瑒t腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，懈怠安臥”。田金州等[11]認(rèn)為，腦髓受損失養(yǎng)，風(fēng)、火、痰、瘀諸邪內(nèi)阻，致腦脈閉阻即發(fā)為VD。崔遠(yuǎn)武[12]認(rèn)為在平臺(tái)期和波動(dòng)期以肝腎陰虛為本，痰瘀為實(shí)，表現(xiàn)為本虛標(biāo)實(shí)。由此可見(jiàn)，VD病位在腦，其病性不外乎虛、痰、瘀、火，相互影響相互轉(zhuǎn)化，其中瘀是關(guān)鍵病機(jī)。艾灸作為中醫(yī)眾多治療手段中獨(dú)具特色的一種治療方法，中醫(yī)針灸工作者在血管性癡呆的臨床治療中，發(fā)現(xiàn)艾灸對(duì)血管性癡呆的獨(dú)特療效[13-15]。百會(huì)穴位于督脈上，膀胱經(jīng)通過(guò)此穴“入絡(luò)腦”;神庭穴為督脈與足太陽(yáng)膀胱經(jīng)的交會(huì)穴，其深部為大腦頂葉、額葉所在，針灸此穴可“氣至病所”從而改善額葉功能。大椎穴為“諸陽(yáng)之會(huì)”，可通調(diào)頭部氣血。臨床借助艾火的“溫經(jīng)通絡(luò)”作用，附子餅的“溫腎補(bǔ)陽(yáng)，培補(bǔ)命門(mén)”作用，因此具“化瘀血，通腦絡(luò)，填髓醒神”之功，稱(chēng)為“化瘀通絡(luò)灸”。有大量試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[16-19]，化瘀通絡(luò)灸法治療能有效改善VD患者臨床癥狀、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，但化瘀通絡(luò)作用機(jī)制關(guān)鍵環(huán)節(jié)不詳，可能存在的促血管生成機(jī)制還不清楚，是否通過(guò)啟動(dòng)了“血管生成”的扳機(jī)而引發(fā)腦內(nèi)學(xué)習(xí)記憶要害部位的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)元保護(hù)作用，其治療作用可能與通過(guò)調(diào)控血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)RAGE和LRP-1的表達(dá)，改善大腦皮層額葉和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元線(xiàn)粒體損傷等方面來(lái)實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)前期課題組查閱了有關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的文獻(xiàn)資料，并調(diào)研了相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員和專(zhuān)家，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前使用的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304作為血管內(nèi)皮細(xì)胞使用存在著一些不確定因素，如有報(bào)道該細(xì)胞株有分化為膀胱內(nèi)皮的傾向，而人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）較為穩(wěn)定，因此最終選取了HUVEC 作為干預(yù)的觀(guān)察對(duì)象。此次試驗(yàn)進(jìn)一步分析血清干預(yù)對(duì)HUVEC-12表達(dá)VEGF、bFGF蛋白影響，獲取化瘀通絡(luò)灸法治療VD的相關(guān)可能機(jī)制。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，VD發(fā)病機(jī)制可能與膽堿能通路損傷、興奮性氨基酸受體發(fā)生激活并導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡、氧化應(yīng)激損傷過(guò)程等有關(guān)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，血管生成和炎癥標(biāo)志物如VEGF、bFGF、MMP1和IL-8與VD的發(fā)生關(guān)聯(lián)密切[21]。VEGF和bFGF能夠協(xié)同作用促進(jìn)成熟血管形成和有絲分裂，兩者在缺血性腦損傷后水平急劇下降[22]，是參與VD病理過(guò)程的重要因子。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性促有絲分裂原，可影響內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞調(diào)控血管生成和成熟。其中VEGF-A具有促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，與神經(jīng)再生關(guān)系密切[23];bFGF作為另一種重要的血管生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)神經(jīng)性血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β的表達(dá)，促進(jìn)軸突分支形成并刺激神經(jīng)前體的增殖和分化[24]。本研究以HUVEC-12作為靶細(xì)胞，對(duì)VD大鼠血清干預(yù)細(xì)胞的VEGF、bFGF蛋白表達(dá)進(jìn)行比較，并對(duì)VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)、神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行檢測(cè)及評(píng)定，發(fā)現(xiàn)化瘀通絡(luò)灸法組的效應(yīng)血清能增強(qiáng)細(xì)胞株表達(dá)VEGF、bFGF血管活性蛋白，提高大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)，揭示化瘀通絡(luò)灸法治療VD的效果及可能的作用機(jī)制，為針灸治療該病的臨床有效性提供理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

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