右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)Wnt/β-catenin蛋白表達的影響

何海娟 楊燕青 鄭波 叢海濤 戴勤學

[摘要] 目的 觀察右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)Wnt/β-catenin蛋白表達的影響。 方法 將48只雄性SD大鼠按隨機區(qū)組的原則分為三組：對照組、模型組和右美托咪定組，每組各16只。采用大腦中動脈阻塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）法制造大鼠腦缺血再灌注損傷模型。右美托咪定組于缺血1 h即刻經(jīng)尾靜脈注射1 μg/kg右美托咪定作為負荷劑量，持續(xù)10 min，隨后以0.5 μg/（kg·h）的速率靜脈輸注至腦缺血2 h。對照組和模型組大鼠按相同方法給予生理鹽水。再灌注24 h時進行神經(jīng)功能評分后處死大鼠取出腦組織，各組取8只大鼠腦組織行TTC染色法測定腦梗死體積，另8只大鼠采用Western blot法檢測大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白表達量。 結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠神經(jīng)行為學評分明顯增加[（3.00±0.82） vs （0±0），P<0.05]、腦梗死體積明顯增加[（64.23±6.72）% vs （0±0）%，P<0.05]，β-catenin蛋白表達量明顯減少（0.46±0.14 vs 1.12±0.23，P<0.05）。與模型組相比，右美托咪定組大鼠神經(jīng)行為學評分（1.69±0.71 vs 3.00±0.82，P<0.05）、腦梗死體積明顯減少[（45.13±8.29）% vs （64.23±6.72）%，P<0.05]，β-catenin蛋白表達量明顯增加[（0.82±0.23） vs （0.46±0.14），P<0.05]。 結(jié)論 右美托咪定能減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機制可能與增加大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白表達量有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血再灌注損傷;右美托咪定;Wnt/β-catenin蛋白;大鼠

[中圖分類號] R614? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）35-0039-04

[Abstract] Objective To observe the effect of dexmedetomidine on Wnt/β-catenin protein expression in cerebral cortex of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods A total of 48 male SD rats were divided into 3 groups according to the principle of randomized block： control group， model group and dexmedetomidine group， with 16 rats in each group. The middle cerebral artery occlusion（MCAO） method was used to make the model of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. In the dexmedetomidine group， 1 μg/kg dexmedetomidine was injected into caudal vein as a loading dose for 10 min immediately after 1 h of ischemia， and then was injected intravenously to cerebral ischemia for 2 h at a rate of 0.5 μg/（kg·h）. Rats in the control group and the model group were given normal saline in the same way. Neurological function scores were concluded 24 h after reperfusion， and then rats were executed for brain tissues to be taken out. Brain tissues of 8 rats in each group were taken out for TTC staining method to measure cerebral infarction volume， and the expression of β-catenin protein in cerebral cortex of the other 8 rats was detected by Western blot method. Results Compared with the control group， in the model group the neurobehavioral scores of the rats were significantly increased （3.00±0.82 vs 0±0， P<0.05）， the cerebral infarction volume was significantly increased[（64.23±6.72）% vs （0±0）%， P<0.05]， and the expression of β-catenin protein was significantly decreased（0.46±0.14 vs 1.12±0.23， P<0.05）. Compared with the model group， in the dexmedetomidine group， the neurobehavioral scores of the rats （1.69±0.71 vs 3.00±0.82， P<0.05） and the cerebral infarction volume[（45.13±8.29）% vs （64.23±6.72）%， P<0.05] were significantly reduced， and the expression of β-catenin protein[（0.82±0.23） vs （0.46±0.14）， P<0.05] was significantly increased. Conclusion Dexmedetomidine can reduce cerebral ischemia-reperfusion injury in rats， and its mechanism may be related to increasing the expression of β-catenin protein in cerebral cortex.

[Key words] Cerebral ischemia-reperfusion injury; Dexmedetomidine; Wnt/β-catenin protein; Rat

目前右美托咪定（Dexmedetomidine）在臨床上應(yīng)用廣泛，其具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗交感活性[1]等作用。研究表明右美托咪定具有臟器保護作用[2]。腦缺血再灌注損傷在臨床上是十分常見并且多發(fā)的疾病，其具體機制十分復雜并不明確[3]。有研究表明右美托咪定具有神經(jīng)保護作用[4]，其可能的機制是增強內(nèi)源性抗氧化酶的活性，減少神經(jīng)元細胞的凋亡，降低血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶以及S100β蛋白濃度等[5]。Wnt/β-catenin信號通路作為一條多環(huán)節(jié)、多作用位點的開放通路，在神經(jīng)系統(tǒng)中起著非常重要的作用[6]。已有文獻證實Wnt/β-catenin信號通路參與了腦缺血損傷的病理生理過程，并且β-catenin蛋白是該信號通路的關(guān)鍵蛋白[7]。那么，β-catenin蛋白是否與右美托咪定的腦保護有關(guān)，值得進一步探索。

1 材料與方法

1.1 動物選擇與分組

健康雄性SD大鼠48只，體重（230±15）g，動物編碼：2010000417632。由溫州醫(yī)科大學動物房提供，飼養(yǎng)于標準動物房中并自由覓食。手術(shù)前一日禁食但不禁飲。將48只SD大鼠按隨機區(qū)組的原則分為三組：對照組、模型組以及右美托咪定組，每組16只。

1.2 給藥方法

右美托咪定組大鼠在腦缺血1 h時，采用微量輸液泵（MICROINFUSION PUMP WZS-50F6，浙江大學醫(yī)學儀器有限公司）經(jīng)尾靜脈注射右美托咪定（批號：16091032，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）1 μg/kg負荷劑量，持續(xù)10 min，然后再以0.5 μg/（kg·h）的速率輸注至腦缺血再灌注2 h。對照組和模型組大鼠按相同方法給予等量生理鹽水。

1.3 模型制備

采用大腦中動脈阻塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）法制造大鼠腦缺血再灌注損傷模型[8]。大鼠采用水合氯醛（10%，400mg/kg）麻醉后，頸部皮膚備皮、消毒后切皮，暴露出大鼠右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（CA）。將ECA結(jié)扎離斷，再將CCA用動脈夾夾住并在ECA殘端處剪一個小口，將線栓圓頭端[直徑為（0.32±0.02） mm，購自北京沙東生物技術(shù)有限公司]置入。用眼科鑷輕推線栓的尾端經(jīng)CCA沿CA進入顱腔，直至大腦中動脈（MCA），遇阻力即止。線栓插入深度18～20 mm。對照組大鼠不阻塞大腦中動脈，其余操作同模型組大鼠。腦缺血再灌注2 h時按照Longa等[8]的評分標準對大鼠進行神經(jīng)功能評分。評分在1分以上的動物作為觀察對象，0分則剔除。整個操作過程中要連續(xù)監(jiān)測大鼠肛溫，保持在（37.0±0.2）℃。

1.4 行為學評分標準

腦缺血再灌注24 h時，由另一個不知分組情況的研究者按照Longa等[8]的方法進行神經(jīng)功能評分法：0分，正常、無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn);1分，輕度神經(jīng)功能障礙，不能完全伸展對側(cè)前肢;2分，中度神經(jīng)功能障礙，爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分，重度神經(jīng)功能障礙，行走時向左側(cè)傾倒;4分，極重度神經(jīng)功能障礙，不能自發(fā)行走伴有意識減退。

1.5 TTC染色法

各組取8只大鼠，采用水合氯醛（10%，400 mg/kg）麻醉后斷頭取腦，用腦模具連續(xù)冠狀切5片，間距為2 mm，放入2%TTC溶液（購于美國Sigma公司）中（37℃，孵育30 min），不定期翻動腦片使其均勻染色，24 h后數(shù)碼相機拍照保存在計算機內(nèi)，采用Image pro plus 6.0圖像分析處理軟件計算腦梗死體積（正常腦組織被染成紅色，梗死區(qū)域被染成白色），梗死體積百分比等于梗死側(cè)的梗死體積/對側(cè)正常體積之比。

1.6 Western-blot技術(shù)

各組剩余8只大鼠處死后取出大腦皮質(zhì)，采用Western blot法檢測β-catenin表達。大腦皮質(zhì)細胞總蛋白的提取采用細胞蛋白提取試劑盒（Thermo公司，美國），按照說明書的步驟操作。等量樣品經(jīng)聚偏二氟乙烯膜分離蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)BSA孵育1 h，再封閉后，分別加入兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），4℃孵育并過夜。室溫下?lián)u床沖洗，再孵育二抗，并化學發(fā)光，顯影、成像。β-actin作為內(nèi)參對照。應(yīng)用Alphaimager 2200凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白，讀出每個條帶的光密度值。蛋白表達水平用β-catenin蛋白條帶光密度值與β-actin條帶光密度值的比值來表示，β-catenin蛋白表達水平=光密度值（β-catenin蛋白條帶）/光密度值（β-actin條帶）。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較均采用單因素方差分析，若方差不齊采用Tamhane檢驗進行兩兩比較;若方差齊采用LSD方法檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠行為學的影響

與對照組比較，模型組大鼠行為學評分明顯增加[（3.00±0.82） vs （0±0），P<0.05]，說明腦缺血再灌注損傷能夠造成大鼠的神經(jīng)運動功能缺陷。與模型組比較，右美托咪定組大鼠行為學評分明顯低于模型組[（1.69±0.71） vs （3.00±0.82），P<0.05]，說明右美托咪定這種藥物可以減少腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)運動功能缺陷。見表1、圖1。

2.2 右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠梗死體積以及大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白表達量的影響

與對照組比較，模型組大鼠大腦梗死體積明顯增加[（64.23±6.72）% vs （0±0）%，P<0.05]，說明大鼠腦缺血再灌注損傷模型的構(gòu)建成功。與模型組相比，右美托咪定組大鼠大腦梗死體積明顯減少[（45.13±8.29）% vs （64.23±6.72）%，P<0.05]，說明右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠具有腦保護作用。見表1、圖2。

與對照組比較，模型組大鼠大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白表達量明顯減少（0.46±0.14 vs 1.12±0.23，P<0.05），說明大鼠腦缺血狀態(tài)下，大腦皮質(zhì)的β-catenin蛋白表達量是下降的。與模型組相比，右美托咪定組大鼠大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白表達量明顯增加（0.82±0.23 vs 0.46±0.14，P<0.05），說明右美托咪定這種藥物可以增加腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白的表達量。見表1、圖3、4。

3 討論

臟器缺血性損傷是圍術(shù)期患者死亡的主要原因之一，也是近年來的研究熱點。其中腦缺血是圍術(shù)期比較常見的并發(fā)癥，也是導致患者遠期學習、記憶以及認知功能障礙的重要原因之一[9]。同時腦缺血性損傷也是引起患者致死率和致殘率最高的疾病之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點[10]，其機制相當復雜，鈣超載、氧自由基的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種因素參與其中[11]。右美托咪定具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抑制交感活性、維持血流動力學平穩(wěn)及無呼吸抑制等特性，廣泛運用于圍術(shù)期患者[12]。目前關(guān)于右美托咪定的腦保護作用非常明確，具體機制有較多的研究，比如抑制TLR4/NF-κB途徑[13]，激活PI3K/Akt/mTOR信號傳導途徑[14]，激活ERK1/2信號通路[15]。但是并未檢索到右美托咪定激活對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用。本實驗采用腦缺血再灌注損傷大鼠為模型，以β-catenin為研究切入點，以神經(jīng)行為學評分和腦梗死體積為觀察指標，目的在于觀察Wnt/β-catenin是否與右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用有關(guān)。

Wnt/β-catenin蛋白廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟過程中起著非常重要的作用[16]。Wnt信號通路參與了多種細胞進程，包括細胞增殖、細胞極化以及細胞死亡。Wnt信號通路激活后，胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin積聚增多并且進入核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子TCF和LEF相結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[17]。局灶腦缺血后Wnt信號的激活能夠恢復神經(jīng)系統(tǒng)功能，誘導神經(jīng)元細胞生發(fā)產(chǎn)生保護效應(yīng)[18]。因此Wnt信號通路在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用。在本研究中，發(fā)現(xiàn)右美托咪定組大鼠行為學評分明顯較模型組大鼠改善（P<0.05），大鼠腦梗死體積也較模型組大鼠明顯減少（P<0.05），說明右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠有腦保護作用，這與他人研究結(jié)論相一致[19-21]。同時本實驗還發(fā)現(xiàn)了右美托咪定組大鼠大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白較模型組大鼠有明顯增加，說明右美托咪定能夠使腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白表達增加。結(jié)合已經(jīng)發(fā)表的文獻，推測右美托咪定可以通過提高大鼠大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白表達，激活Wnt信號通路，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄過程，導致腦內(nèi)保護性物質(zhì)合成增多，達到腦保護的作用。

本文發(fā)現(xiàn)右美托咪定能夠提高腦缺血再灌注損傷大鼠的β-catenin的表達量，而β-catenin是Wnt信號通路中一個關(guān)鍵作用位點，因此本實驗結(jié)果提示右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用，可能與激活Wnt信號通路有關(guān)。當然本實驗也有不足之處，未能采用Wnt/β-catenin的拮抗劑Dkk-1觀察右美托咪定的腦保護效應(yīng)能否被Dkk-1所拮抗，進一步明確Wnt/β-catenin信號通路參與右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用。

綜上所述，右美托咪定能減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機制可能與增加大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白表達量有關(guān)。

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（收稿日期：2019-12-18）