2次克隆轉(zhuǎn)基因山羊的重構(gòu)胚發(fā)育分析

宋紹征，陸 睿，張 婷,潘生強(qiáng)，成 勇，周鳴鳴*

(1.無(wú)錫太湖學(xué)院 護(hù)理學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫 214000；2.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥工程研究中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，制藥工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

從20世紀(jì)70年代開始，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)逐漸成為生物醫(yī)學(xué)研究最廣泛的手段之一[1]。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將預(yù)先設(shè)計(jì)的外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞或配子內(nèi)，構(gòu)建整合有外源基因的重構(gòu)胚來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[2]。目前，制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法較多，最常見的是顯微注射和體細(xì)胞核移植[3-5]。自1997年英國(guó)科學(xué)家WILMUT等[6]獲得了世界首例體細(xì)胞克隆羊“多莉”以來(lái)，體細(xì)胞核移植迅速成為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用最廣泛的一種技術(shù)。該方法主要是通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染將外源基因?qū)塍w外培養(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞，篩選鑒定后將陽(yáng)性整合細(xì)胞株作為供核細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物克隆，已經(jīng)成功地在牛、羊、豬、兔和小鼠等多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中應(yīng)用[7-13]。

通過體細(xì)胞核移植制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的前提是獲得可控性的供核細(xì)胞，胎兒成纖維細(xì)胞具有全能干細(xì)胞潛能，容易分離獲得和培養(yǎng)轉(zhuǎn)染，是一種比較合適的供核細(xì)胞[14]。但原代胎兒細(xì)胞的體外培養(yǎng)傳代次數(shù)也是有限的，山羊胎兒成纖維細(xì)胞有40～120個(gè)細(xì)胞分裂代次[15-16]。長(zhǎng)期的體外轉(zhuǎn)染、篩選和傳代培養(yǎng)，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞變得衰老，活力和生長(zhǎng)潛能下降，同時(shí)也增加了遺傳突變幾率。2次克隆是指通過剖宮產(chǎn)獲取克隆胎兒細(xì)胞進(jìn)行的再次動(dòng)物克隆，避免了供核細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)所造成的老化現(xiàn)象。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道[17-19]，利用轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的胎兒成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞進(jìn)行再克隆，能夠提高重構(gòu)胚的發(fā)育率和受體妊娠率，挽救早期可能隱性流產(chǎn)的胎兒，從而提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備效率。

因此，本研究應(yīng)用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備LYZ和Blac轉(zhuǎn)基因山羊，并通過2次克隆的方法來(lái)再次制備轉(zhuǎn)基因山羊，比較2次克隆的轉(zhuǎn)基因山羊重構(gòu)胚發(fā)育情況，旨在為今后高效生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒BLYZ質(zhì)粒菌種(圖1A，含山羊BLG調(diào)控序列、LYZ cDNA、NEO基因、CMV增強(qiáng)子等)，Blac質(zhì)粒菌種(圖1B，山羊BLG調(diào)控序列、hα-LA cDNA、NEO基因、CMV增強(qiáng)子等)以及宿主菌DH5α均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1 BLYZ和Blac乳腺特異性表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 引物本研究所有的PCR引物均借助于Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)完成，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 檢測(cè)所用引物

1.3 主要試劑DMEM/F12 (Hyclone，CatNo.D2906)、G418(Amesco,CatNo.0344)、FBS (Hyclone，CatNo.SH30070.03)、Trypsin (Amresco，Cat No.0458)、促黃體素釋放激素(LHRH，Cat No.20071203)、氯前列烯醇(PG，Cat No.070102)和促卵泡生長(zhǎng)激素(FSH，Cat No.20080509)均購(gòu)自寧波激素廠；M2、M16、青鏈霉素、透明質(zhì)酸酶、細(xì)胞松弛素B、核熒光染料Hochest 33342、6-甲基氨基蝶呤、離子霉素等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DNA 膠純化回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN 公司；各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；其他未說明試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，分別購(gòu)自上海藥劑有限公司、上海生工生物工程有限公司和南京生興生物有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)中使用的薩能奶山羊和徐淮白山羊均來(lái)自于揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)，常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.5 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)無(wú)菌手術(shù)剖宮產(chǎn)獲取35日齡奶山羊胎兒，D-Hank’s緩沖液洗滌2次，去除頭、四肢和內(nèi)臟團(tuán)，剪碎剩下組織成約1 mm3大小，D-Hank’s緩沖液洗滌2次后，置于潔凈離心管內(nèi)，添加5 mL消化液 (含0.05% 胰酶 + 0.04% EDTA)，移液管反復(fù)吹打消化15 min，靜置1 min，取上層渾濁液于另一潔凈離心管，D-Hank’s緩沖液離心洗滌3次。細(xì)胞計(jì)數(shù)并用正常培養(yǎng)液 (含DMEM/F12+10% FBS) 調(diào)整密度至 5×105個(gè)/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液。剩余未消化組織按照上述步驟繼續(xù)消化至組織塊基本消失。

1.6 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的建立待山羊胎兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至約80%時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。BLYZ和Blac乳腺特異性表達(dá)載體經(jīng)SalⅠ、NotⅠ雙酶切線性化和QIAGEN試劑盒純化后，分別與細(xì)胞懸液混合，用電轉(zhuǎn)染液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL、基因終質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，開始電轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染條件為2 mm間隙電極杯、2.0 kV/cm、300 μs、電擊2次，靜置2 min。轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)液 (含DMEM/F12+10% FBS) 中，接種于6孔板中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞作陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，添加含500 mg/L的G418培養(yǎng)液進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每2 d換液1次。篩選培養(yǎng)10～14 d后，即所有正常細(xì)胞對(duì)照組均死亡時(shí)，挑取單克隆細(xì)胞株于48孔板內(nèi)，更換正常培養(yǎng)液 (含DMEM/F12+10% FBS) 繼續(xù)培養(yǎng)，后續(xù)傳代于12孔板內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合到約80%～90%時(shí)，收集細(xì)胞，其中一部分細(xì)胞凍存 (含DMEM/F12 + 10% DMSO + 20% FBS) 以作體細(xì)胞核移植的供核細(xì)胞；另一部分細(xì)胞提取DNA以作PCR檢測(cè)。應(yīng)用CMV-LYZ-F/R引物進(jìn)行人溶菌酶基因整合檢測(cè)，應(yīng)用CMV-LA-F/R引物進(jìn)行人α-乳白蛋白基因整合檢測(cè)，引物序列見表1。

1.7 供質(zhì)羊和受體羊的準(zhǔn)備選取正常成年雌性徐淮白山羊作為供質(zhì)羊，查情后9～13 d開始肌肉注射FSH，連續(xù)3 d，每天早晚各1次，總劑量300 IU/只。第4天肌肉注射氯前列烯醇0.1 mg/只，第5天肌肉注射LHRH 100 μg/只。同步發(fā)情處理寄母羊。

1.8 核移植、融合與激活37℃復(fù)蘇冷凍細(xì)胞后，置于12孔板內(nèi)以正常培養(yǎng)液(含DMEM/F12+10% FBS)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)，更換為含0.5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，饑餓培養(yǎng)48 h，使用M2溶液收集細(xì)胞備用。卵母細(xì)胞置于含7.5 mg/L CB和 5 mg/L Hochest 33342的M2溶液中處理0.5 h，在熒光倒置顯微鏡下去除第一極體和細(xì)胞核后，移入供核細(xì)胞，形成重構(gòu)卵。

重構(gòu)卵在M16溶液中培養(yǎng)30 min后，進(jìn)行融合，融合液為0.3 mmol/L甘露醇+0.05 mmol/L 氯化鈣+0.05 mmol/L 硫酸鎂+2% BSA，融合參數(shù)為1.0 kV/cm、50 μs、2個(gè)脈沖。M16溶液培養(yǎng)0.5 h 后觀察，未融合卵進(jìn)行二次融合。

融合卵在M16溶液中培養(yǎng)5 h后，開始激活(激活液：M16培養(yǎng)液+7.5 mg/L CB +5 μmol/L 離子霉素)，精確控制5 min,然后在含7.5 mg/L CB 和2 mmol/L 6-DMAP的M16溶液中培養(yǎng)5 h,最后轉(zhuǎn)移到正常M16溶液中培養(yǎng)，直到胚胎移植[14]。

1.9 胚胎移植與妊娠診斷第2天觀察重構(gòu)胚發(fā)育情況，挑取發(fā)育至2～4細(xì)胞的重構(gòu)胚通過無(wú)菌手術(shù)移植入同步發(fā)情的寄母山羊輸卵管內(nèi)，每只受體山羊移植4～10枚胚胎，經(jīng)30～35 d后進(jìn)行B超妊娠診斷，妊娠羊統(tǒng)一加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。

1.10 胎兒細(xì)胞的再克隆挑取B超診斷為妊娠的山羊，無(wú)菌手術(shù)剖宮產(chǎn)獲取35日齡轉(zhuǎn)基因克隆胎兒，按照1.5的方法獲得細(xì)胞系，通過PCR進(jìn)行外源基因整合檢測(cè)，應(yīng)用CMV-LYZ-F/R引物進(jìn)行溶菌酶基因整合檢測(cè)，應(yīng)用CMV-LA-F/R引物進(jìn)行人α-乳白蛋白基因整合檢測(cè)。確定胎兒細(xì)胞整合外源基因后，凍存細(xì)胞(DMEM/F12+20% FBS+10% DMSO)保存于液氮中備用。

37℃復(fù)蘇胎兒細(xì)胞，按照1.7、1.8和1.9的方法分別重新制備LYZ和hα-LA轉(zhuǎn)基因山羊,30～35 d 后進(jìn)行B超診斷，妊娠山羊定期復(fù)檢，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理直至分娩。

2 結(jié)果

2.1 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)利用胰蛋白酶消化獲得的山羊胎兒成纖維細(xì)胞屬于一種貼壁細(xì)胞，形態(tài)較小，呈梭形長(zhǎng)條狀、渦旋狀、放射狀或不規(guī)則狀。肉眼可見細(xì)胞群內(nèi)有散落的白色集落形成，密度過大時(shí)細(xì)胞相互擠壓呈細(xì)長(zhǎng)條狀，典型的山羊胎兒成纖維細(xì)胞如圖2所示。

圖2 山羊胎兒成纖維細(xì)胞(100×)

2.2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的獲得BLYZ和Blac載體分別電轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞2×106個(gè)，經(jīng)G418篩選，BLYZ載體獲得83株藥物抗性細(xì)胞，Blac獲得69株藥物抗性細(xì)胞。應(yīng)用CMV-LYZ-F/R引物進(jìn)行LYZ基因整合檢測(cè)，獲得74株LYZ轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為852 bp(圖3)。應(yīng)用CMV-LA-F/R引物進(jìn)行hα-LA基因整合檢測(cè)，獲得62株hα-LA轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為843 bp(圖4)。

圖3 部分LYZ基因整合檢測(cè)PCR圖 M.DL2000 DNA Marker;P.BLYZ vector;N.Untransfected normal cells;B.Blank control;1～21.transfected cell samples

圖4 部分hα-LA基因整合檢測(cè)PCR圖 M.DL2000 DNA Marker;P.Blac vector;N.Untransfected normal cell;B.Blank control;1～17.transfected cell samples

2.3 重構(gòu)胚的發(fā)育情況與轉(zhuǎn)基因克隆胎兒驗(yàn)證BLYZ載體共超排獲得382枚山羊卵母細(xì)胞，去核卵296枚，去核率為77.5%(296/382)；融合后獲得235枚重構(gòu)卵，融合率為79.4%(235/296)；激活后培養(yǎng)至第2天觀察，發(fā)育為2～4細(xì)胞的重構(gòu)胚有84枚，發(fā)育率為35.7%(84/235)；挑取2～4細(xì)胞的重構(gòu)胚移植入13只受體山羊體內(nèi)，30～35 d進(jìn)行B超妊娠診斷，5只妊娠，妊娠率為38.5%(5/13)，見表2。

Blac載體共超排獲得353枚山羊卵母細(xì)胞，去核卵287枚，去核率為81.3%(287/353)；融合后獲得221枚重構(gòu)卵，融合率為77.0%(221/287)；激活后培養(yǎng)至第2天觀察，發(fā)育為2～4細(xì)胞的重構(gòu)胚有73枚，發(fā)育率為33.0%(73/221)；挑取2～4細(xì)胞的重構(gòu)胚移植入11只受體山羊體內(nèi)，30～35 d進(jìn)行B超妊娠診斷，4只妊娠，妊娠率為36.4%(4/11)，見表2。

分別無(wú)菌手術(shù)剖宮產(chǎn)獲取35日齡BLYZ克隆胎兒和Blac克隆胎兒各1只(圖5)，并建立細(xì)胞系，PCR檢測(cè)驗(yàn)證該2只克隆胎兒及建立的細(xì)胞系均為轉(zhuǎn)基因克隆胎兒，如圖6所示。

表2 體細(xì)胞核移植生產(chǎn)LYZ和Blac轉(zhuǎn)基因克隆胎兒統(tǒng)計(jì)(含二次克隆)

圖5 35日齡的BLYZ和Blac轉(zhuǎn)基因克隆胎兒圖片

圖6 BLYZ和Blac轉(zhuǎn)基因克隆胎兒整合檢測(cè)PCR圖 M.DL2000 DNA Marker;P.BLYZ vector;N.Untransfected normal cells;B.Blank control;1～21.transfected cell samples

2.4 2次克隆重構(gòu)胚的發(fā)育情況剖宮產(chǎn)獲取的35日齡BLYZ和Blac轉(zhuǎn)基因克隆胎兒建立細(xì)胞系進(jìn)行的2次克隆重構(gòu)胚發(fā)育情況詳見表2，分別超排獲得172和190枚山羊卵母細(xì)胞，去核卵分別為131枚和145枚，去核率分別為76.2%(131/172)和76.3%(145/190)；融合后分別獲得118枚和127枚重構(gòu)卵，融合率分別為90.1%(118/131)和87.6%(127/145)；激活后培養(yǎng)至第2天觀察，發(fā)育為2～4細(xì)胞的重構(gòu)胚分別有79枚和87枚，發(fā)育率分別為66.9%(79/118)和68.5%(87/127)。挑取2～4細(xì)胞的BLYZ重構(gòu)胚移植入12只受體山羊體內(nèi)，30～35 d進(jìn)行B超妊娠診斷，7只妊娠，妊娠率為58.3%(7/12)；挑取2～4細(xì)胞的Blac重構(gòu)胚移植入13只受體山羊體內(nèi)，30～35 d進(jìn)行B超妊娠診斷，8只妊娠，妊娠率為61.5%(8/13)。通過2次克隆獲得的轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚融合率、發(fā)育率和移植受體妊娠率均明顯高于傳統(tǒng)的體細(xì)胞核移植。

3 討論

動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要包括顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、精子載體法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、體細(xì)胞核移植法等，能夠打破種間隔離，使特定的基因按照人類的要求在不同物種間進(jìn)行交流，是生命科學(xué)研究最常見的技術(shù)之一，已在基因表達(dá)調(diào)控研究、人類疾病模型制作、人體器官生產(chǎn)與器官移植、動(dòng)物生物反應(yīng)器、動(dòng)物品種改良等方面得到了廣泛的應(yīng)用[20]。體細(xì)胞核移植是目前生產(chǎn)大中型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用最廣泛的一種方法[5]，大部分體細(xì)胞核移植的供核細(xì)胞均來(lái)自于長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)，存在細(xì)胞生長(zhǎng)潛能下降、容易老化等缺陷，影響重構(gòu)胚的融合和發(fā)育情況，且出生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物健康狀況也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，最終導(dǎo)致生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的效率低下。因此，如何積極探索一種能夠保持供核細(xì)胞活力的方法至關(guān)重要。

本研究采用2次克隆來(lái)再次制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，無(wú)論在重構(gòu)胚的融合率、發(fā)育率還是移植受體妊娠率方面均明顯高于傳統(tǒng)的體細(xì)胞核移植，這一結(jié)果提示應(yīng)用2次克隆法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是高效可行的。該方法主要是直接利用克隆胎兒建立的細(xì)胞系作為供核細(xì)胞來(lái)進(jìn)行核移植制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這樣供核細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)間較短，也無(wú)需轉(zhuǎn)染、克隆化篩選和檢測(cè)等繁瑣程序，細(xì)胞能夠保持原有的生長(zhǎng)潛能，活力較高，可使其具有重編程潛能在重構(gòu)胚胎后發(fā)育到完整個(gè)體，挽救早期隱性流產(chǎn)的胎兒，提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作效率[21-22]。BRESSAN等[17]比較了以長(zhǎng)時(shí)間體外篩選培養(yǎng)的整合外源基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞進(jìn)行的第1輪克隆和以克隆胎兒細(xì)胞系作為供核細(xì)胞的2次克隆情況，發(fā)現(xiàn)2次克隆的重構(gòu)胚發(fā)育率和移植受體的妊娠率明顯提高。FUJIMURA等[18]報(bào)道，在基因打靶動(dòng)物的制作中，通過2次連續(xù)再克隆能有效提高基因打靶動(dòng)物制作的效率。AHN等[19]報(bào)道了通過2次再克隆挽救了在第1輪克隆中出生后死亡的基因打靶動(dòng)物，從而使具有珍貴基因型的動(dòng)物復(fù)活。2次克隆雖然能夠提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作效率，但是在轉(zhuǎn)基因山羊中的應(yīng)用報(bào)道較少。

本研究通過電轉(zhuǎn)染法分別獲得LYZ轉(zhuǎn)基因細(xì)胞74株、hα-LA轉(zhuǎn)基因細(xì)胞62株。第1輪通過這種長(zhǎng)期體外篩選培養(yǎng)的細(xì)胞作為供核細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因山羊，其中BLYZ載體的重構(gòu)卵融合率為79.4%(235/296)，2～4細(xì)胞的發(fā)育率為35.7%(84/235)，移植入同步發(fā)情的山羊受體妊娠率為38.5%(5/13)；Blac載體的重構(gòu)卵融合率為77.0%(221/287)，2～4細(xì)胞的發(fā)育率為33.0%(73/221)，移植入同步發(fā)情的山羊受體妊娠率為36.4%(4/11)。以剖宮產(chǎn)獲取克隆胎兒建立的細(xì)胞系作為供核細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因山羊的2次克隆法，BLYZ載體的重構(gòu)卵融合率為90.1%(118/131)，2～4細(xì)胞的發(fā)育率為66.9%(79/118)，移植入同步發(fā)情的山羊受體妊娠率為58.3%(7/12)；Blac載體的重構(gòu)卵融合率為87.6%(127/145)，2～4細(xì)胞的發(fā)育率為68.5%(87/127)，移植入同步發(fā)情的山羊受體妊娠率為61.5%(8/13)。綜上結(jié)果所示，首輪體細(xì)胞核移植制備轉(zhuǎn)基因山羊的重構(gòu)胚發(fā)育率和受體妊娠率平均為34.4%和37.5%，而通過2次克隆再次核移植制備轉(zhuǎn)基因山羊的重構(gòu)胚發(fā)育率和受體妊娠率平均為67.8%和60.0%，明顯高于傳統(tǒng)的體細(xì)胞核移植。此外，本研究中設(shè)計(jì)了2種基因(BLYZ和Blac)進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)基因之間無(wú)明顯差異，這2種轉(zhuǎn)基因的2次克隆法均明顯高于傳統(tǒng)的第1輪體細(xì)胞核移植法。這與其他學(xué)者在不同動(dòng)物中的2次連續(xù)克隆研究報(bào)道相吻合[17-19,23]。

總之，本研究對(duì)第1輪體細(xì)胞核移植和2次克隆的重構(gòu)胚發(fā)育情況進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明2次克隆法獲得的重構(gòu)胚融合率、發(fā)育率和受體妊娠率均顯著高于傳統(tǒng)的體細(xì)胞核移植法，其中發(fā)育率和妊娠率分別高達(dá)67.8%和60.0%。這為今后大量生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊和其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供了科學(xué)依據(jù)，也為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物遺傳育種奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。