黃芪總黃酮體外抗炎作用及對MAPKs信號通路的調(diào)控

周鴻緣，張 賢，王 萌，葛冰潔，王 政，李海濤,2* ，張雪梅*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112)

炎癥是保護(hù)宿主免受病原體或機械損傷的基本免疫反應(yīng)[1]。動物傳染性疾病、寄生蟲所致病變以及一些外傷都可以使動物產(chǎn)生炎癥病變，在獸醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究愈發(fā)重要[2]。黃芪為豆科植物黃芪的干燥根，其擁有悠久的藥用歷史[3]。黃芪成分眾多，主要包括黃芪多糖類、黃酮類、皂苷類、氨基酸、生物堿及多種微量元素[4]。黃芪總黃酮(TFA)作為黃芪的主要有效成分，可以提高機體對損傷的抵抗力，具有抗炎、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抑制動脈粥樣硬化等生物學(xué)效應(yīng)[5-6]。

LPS是一種常用的炎癥誘導(dǎo)劑，通過刺激TLR4途徑發(fā)揮作用，從而激活其下游相關(guān)信號通路，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子，可見巨噬細(xì)胞在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[7]。本試驗以傳統(tǒng)中藥黃芪的主要成分TFA為研究對象，以LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞為模型，從炎性介質(zhì)、炎性因子以及MAPKs信號通路3個部分探討其體外抗炎作用及其機制，為TFA的進(jìn)一步研究與開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與藥物小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7來源于北京協(xié)和細(xì)胞中心；TFA購于南京澤朗生物公司。

1.2 主要試劑LPS、DMSO和MTT購自Sigma公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；NO、PGE2檢測試劑盒購于碧云天生物研究所；細(xì)胞因子ELISA試劑盒購于R&D公司；RT-PCR一步法轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司；蛋白裂解液購于索萊寶試劑有限公司；一抗iNOS、COX-2與p38、ERK1/2、JNK、p-p38、p-ERK1/2、p-JNK以及二抗山羊抗鼠單抗購于Santa Cruz公司。

1.3 MTT法檢測TFA細(xì)胞毒性正常條件下培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞至對數(shù)生長期，配置細(xì)胞濃度為5×105個/mL的細(xì)胞懸液。每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板上，根據(jù)試驗分組加入不同質(zhì)量濃度梯度的TFA(0～200 mg/L)，設(shè)重復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h后，每孔加入50 μL MTT，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h，再用1 mg/L DMSO溶解沉淀，酶聯(lián)免疫檢測儀測定在490 nm處吸光度，計算細(xì)胞存活率。

1.4 Griess法和ELISA法檢測炎性介質(zhì)NO和PGE2的含量以l mg/L LPS誘導(dǎo)的RAW264.7為模型進(jìn)行試驗，分別設(shè)立空白組、模型組以及TFA低、中、高(10,25和100 mg/L)劑量組。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL接種于96孔板上，設(shè)立重復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后，分別用不同濃度的TFA處理。收集細(xì)胞上清液，用Griess法和ELISA法檢測各試驗組在3,6,12,24 h時RAW 264.7細(xì)胞上清液中NO和PGE2的含量。

1.5 ELISA法檢測炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量試驗分組、建模及給藥流程同步驟1.4，收集細(xì)胞上清液與細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀留為后續(xù)試驗備用。按照細(xì)胞因子檢測試劑盒操作說明，測定各試驗組在3,6,12,24 h時RAW 264.7細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌量。

1.6 RT-PCR法檢測iNOS和COX-2 mRNA的含量收集步驟1.5在12 h所保留的細(xì)胞沉淀，PBS緩沖液洗滌離心后，使用Trizol、異丙醇、無菌水等試劑提取各試驗組RAW264.7細(xì)胞總RNA，并測定其濃度與純度，依照RT-PCR一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增試驗，再通過1%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳對各組iNOS和COX-2 的PCR產(chǎn)物進(jìn)行含量分析。PCR擴增序列引物設(shè)計如下：其中COX-2(F):5′-GGAGAGACTATCAAGATAGT-3′;COX-2(R):5′-ATGGTCAGTAGACT-TTTACA-3′。INOS(F):5′-GAGCGAGTTGTGGATTGTC;INOS(R):CTCCTTTGAGCCCTTTGT-3′。β-actin(F):CTGTCCCTGTATGCCTC-TG-3′;β-actin(R):5′-ATGTCACGCACGAT-TTCC-3′。

1.7 Western blot法檢測MAPKs信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)使用無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶在正常條件下培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞至對數(shù)生長期，根據(jù)步驟1.4進(jìn)行試驗分組、建模與給藥。培養(yǎng)12 h后收集各試驗組細(xì)胞沉淀，用RIPA蛋白裂解液(含PMSF)提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。各試驗組樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，4℃過夜孵育一抗(iNOS、COX-2與p38、ERK1/2、JNK及其磷酸化抗體)，室溫孵育二抗(山羊抗鼠單抗)，最后用ECL顯色液在成像系統(tǒng)下觀察iNOS和COX-2蛋白表達(dá)水平以及MAPK信號通路中p38、ERK1/2、JNK的磷酸化水平。

1.8 結(jié)果處理與統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 20.0軟件，對統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行單因素ANOVA、t檢驗比較。P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 TFA細(xì)胞毒性測定結(jié)果用MTT法檢測經(jīng)TFA處理后RAW264.7細(xì)胞的存活率，確定TFA的安全給藥劑量。由圖1可知，0～100 mg/L TFA對RAW264.7細(xì)胞無明顯毒性；當(dāng)TFA質(zhì)量濃度高于150 mg/L時，出現(xiàn)顯著毒性(P<0.05)。根據(jù)這一結(jié)果，確定TFA最大安全質(zhì)量濃度為100 mg/L。因此，擬定TFA低、中、高劑量組的給藥質(zhì)量濃度分別為10,25,100 mg/L。

2.2 TFA對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎性介質(zhì)NO和PGE2含量的影響NO和PGE2的含量變化如表1所示，與空白組相比，LPS刺激后細(xì)胞上清液中NO含量顯著增加，3 h后差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，高劑量組NO含量在6，12和24 h均呈極顯著差異(P<0.01)；TFA中劑量組NO含量在6，24 h顯著下降(P<0.05)，在12 h極顯著下降(P<0.01)；TFA低劑量組NO含量在給藥12 h后極顯著降低(P<0.01)。說明TFA能不同程度地抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞的NO含量。

圖1 TFA對RAW264.7細(xì)胞的毒性測定結(jié)果

模型組與空白組相比，細(xì)胞上清液中PGE2含量變化極顯著(P<0.01)；與模型組相比，TFA高劑量組PGE2含量在4個時間點上均呈極顯著下降趨勢(P<0.01)；TFA中劑量組PGE2含量在3，6和24 h均呈極顯著下降趨勢(P<0.01)，在12 h呈顯著下降趨勢(P<0.05)；TFA低劑量組PGE2含量在6 h極顯著下降(P<0.01)，在12 h顯著下降(P<0.05)。說明TFA能不同程度地下調(diào)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞的PGE2含量。

表1 TFA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO和PGE2含量的影響

2.3 TFA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ分泌的影響各試驗組RAW264.7細(xì)胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量見表2。與空白組相比，LPS刺激后，模型組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均極顯著上升(P<0.01)。

與模型組相比，TFA高劑量組IL-1β含量在4個時間點上均呈極顯著下降趨勢(P<0.01)，而TFA中、低劑量組IL-1β也顯示出一定的下降趨勢，且在相同時間點滿足一定的劑量依賴關(guān)系；TFA中劑量組IL-6含量在3，6 h極顯著下降(P<0.01)，在12 h后顯著下降(P<0.05)，TFA高、低劑量組IL-6含量在4個時間點上均呈極顯著下降趨勢(P<0.01)；TFA高劑量組TNF-α含量均極顯著降低(P<0.01)，而TFA中、低劑量組對TNF-α含量在不同時間點也有一定的抑制效果；TFA高劑量組IFN-γ含量呈極顯著下降趨勢(P<0.01)，TFA中劑量組IFN-γ含量在6,12和24 h顯著降低(P<0.05)，TFA低劑量組IFN-γ的含量在6，12 h也顯著降低了(P<0.05)。說明TFA在一定程度上可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)條件下RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的過度分泌。

表2 TFA對LPS誘導(dǎo)條件下RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ分泌的影響

2.4 TFA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)的影響由圖2可知，與空白組相比，模型組RAW264.7細(xì)胞iNOS和COX-2 mRNA的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，TFA各劑量組均能有效降低 iNOS mRNA表達(dá)量(P<0.01)；TFA高、中劑量組COX-2 mRNA表達(dá)量沒有顯著差異(P>0.05)，而TFA低劑量組iNOS mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)極顯著降低趨勢(P<0.01)。說明TFA在一定條件下可有效抑制iNOS和COX-2mRNA的過度表達(dá)。

圖2 TFA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)的影響

2.5 TFA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如圖3所示，與空白組相比，模型組RAW264.7細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，TFA高、中劑量組iNOS蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，TFA低劑量組iNOS蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；TFA各劑量組COX-2蛋白量均呈極顯著下降趨勢(P<0.01)。說明TFA各劑量組均能有效抑制iNOS和COX-2蛋白表達(dá)，且呈一定劑量依賴性。

圖3 TFA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響

2.6 TFA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞MAPKs信號通路的影響為進(jìn)一步研究TFA抗炎機制，本試驗檢測了MAPKs信號通路p38、JNK、ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果如圖4所示，與空白組相比，模型組RAW264.7 細(xì)胞p-p38、p-JNK和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)量均極顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，TFA高、中、低劑量組RAW264.7 細(xì)胞p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)量均呈極顯著下降趨勢(P<0.01)，且具有一定的劑量依賴性；TFA各劑量組p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。說明TFA可降低MAPKs信號通路關(guān)鍵蛋白p38和JNK的過度磷酸化。

圖6 TFA對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞p-p38、p-JNK和p-ERK1/2的調(diào)控

3 討論

炎癥反應(yīng)會對動物機體造成極大的傷害，重則可使器官衰竭而引發(fā)死亡[8]。目前，常用抗炎藥物仍以甾體類和非甾體類等西藥為主，雖然療效顯著，但也顯示出諸多弊端。近年來隨著對中藥抗炎作用的研究，越來越多的中藥及有效成分以其毒副作用低、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，成為繼甾體類和非甾體類抗炎藥之后的又一類應(yīng)用廣泛的抗炎藥物[9]。本實驗室已有研究表明，傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分TFA顯示出明顯的體內(nèi)抗炎效果[10-11]，但其抗炎機制不清楚。因此，本研究以LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞為模型，以TFA為研究對象，來探討TFA的體外抗炎作用及機制。

炎癥作為一種先天性免疫反應(yīng)，主要由巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)，進(jìn)而分泌多種炎性介質(zhì)和炎性因子增強機體的免疫應(yīng)答，是機體免疫調(diào)控系統(tǒng)中一個重要環(huán)節(jié)，但炎性介質(zhì)和炎性因子的過度分泌將會刺激進(jìn)一步的細(xì)胞損傷，加重炎癥反應(yīng)[14]。而且，炎性因子與炎性介質(zhì)之間會產(chǎn)生產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，如IL-1β和TNF-α最容易刺激細(xì)胞分泌PGE2，IFN-γ還會誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生[15]。此外，iNOS和COX-2的表達(dá)調(diào)節(jié)也是許多炎癥發(fā)病過程中的關(guān)鍵因素，并在相關(guān)疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。iNOS表達(dá)增加，過量釋放有毒介質(zhì)NO，引起組織和細(xì)胞損傷，從而加重炎癥反應(yīng)[12]。PGE2是COX-2刺激的首要產(chǎn)物，也是一種重要的炎性介質(zhì)，PGE2的增加同樣會加重炎癥的發(fā)展[13]。根據(jù)ELISA結(jié)果得出，TFA可抑制炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ的過度分泌，說明TFA具有一定的抗炎效果。RT-PCR與Western blot試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TFA可以抑制RAW264.7細(xì)胞iNOS、COX-2 mRNA和蛋白的過度表達(dá)，降低細(xì)胞上清液中NO與PGE2的含量。因此，通過抑制iNOS、COX-2的表達(dá)來抑制炎性介質(zhì)NO和PGE2的產(chǎn)生可能是治療炎癥的一個有效途徑。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是與細(xì)胞生長關(guān)系最密切的一類蛋白激酶，可被多種刺激如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激等活化。MAPKs信號通路是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，是連接細(xì)胞內(nèi)外反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)，可介導(dǎo)胞外信號刺激傳入胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞過程[16]。在哺乳動物中，參與炎癥反應(yīng)的MAPKs家族成員主要分為p38、ERK1/2、JNK[17]。LPS刺激巨噬細(xì)胞后激活不同的MAPKs信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎性因子和炎性介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成等多種生理及病理過程，同時，MAPKs信號通路的異?；蜻^度活化也是細(xì)胞炎癥加重的重要因素[18]。本試驗通過Western blot法得出，TFA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞MAPKs信號通路中的p-p38和p-JNK蛋白表達(dá)具有抑制作用，但TFA各劑量組對p-ERK1/2蛋白表達(dá)抑制效果不明顯;說明TFA能夠抑制RAW264.7細(xì)胞MAPKs通路中p38和JNK的過度磷酸化。

綜上所述，TFA能明顯降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中炎性介質(zhì)NO、PGE2及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量，同時，TFA也顯著抑制了iNOS和COX-2的mRNA和蛋白的過度表達(dá)，證明TFA具有明顯的體外抗炎效果。進(jìn)一步，TFA可調(diào)控p38和JNK的磷酸化水平，說明TFA的抗炎作用可能與抑制MAPKs信號通路活化有關(guān)，進(jìn)而下調(diào)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的過量分泌。此外，TFA體外抗炎機制也要針對其他炎癥相關(guān)通路以及采用不同特異性抑制劑來深入探究，從而為研發(fā)安全高效的抗炎藥物提供理論依據(jù)，為獸醫(yī)臨床的炎癥治療提供新導(dǎo)向。