輪狀病毒為主的混合感染性犢牛腹瀉病的診斷

彭清潔，劉 心，晁 金，楊 莉，陳 鳴，薛凱麗 ，張淏云，朱 杰,朱小潔，陳穎鈺,3,4,胡長敏,3，陳 曦,3，郭愛珍,3,4*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070;2.國家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制功能研究室，湖北 武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070;4.湖北省獸醫(yī)流行病學(xué)國際科技合作基地，湖北 武漢 430070)

隨著我國奶牛養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，犢牛腹瀉的危害已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。犢牛腹瀉的高發(fā)病率和高死亡率是造成牧場經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一，且影響奶牛后期的生長性能。除了飼養(yǎng)管理?xiàng)l件的原因，大腸桿菌K99+、牛輪狀病毒、小球隱孢子蟲、牛冠狀病毒也被認(rèn)為是導(dǎo)致犢牛腹瀉的主要病原[1]。

新生犢牛中輪狀病毒引起的犢牛腹瀉較為常見，一般 0～10 日齡易感。據(jù)報(bào)道，牛輪狀病毒廣泛存在于犢牛。在犢牛出生2周內(nèi)，牛輪狀病毒的分離率高達(dá)94%[2]。同時(shí)，輪狀病毒引起的腸細(xì)胞損傷更有利于產(chǎn)毒素性大腸桿菌的附著和感染，這種混合感染可導(dǎo)致犢牛發(fā)生更嚴(yán)重的腹瀉和更高的死亡率[3]。

1 材料與方法

1.1 病例背景2019年4月13號，研究室接到內(nèi)蒙古某牛場的電話咨詢，通過農(nóng)場主描述得知：該場共1 608頭黑安格斯牛，均為澳大利亞進(jìn)口，其中犢牛350頭。牛場從3月末4月初開始，3日齡犢牛陸續(xù)開始出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，拉黃色稀糞，用土霉素、氟尼辛葡甲胺注射液、樟腦磺酸鈉、碳酸氫鈉藥物治療后少數(shù)牛病情有所好轉(zhuǎn)，但隨即復(fù)發(fā)；腹瀉牛4～5 d后糞便轉(zhuǎn)為白、灰色稀糞。犢牛發(fā)病率為28.5%(100/350)，病死率為5.7%(20/350)。為確診病因，研究室展開了對該場的現(xiàn)場調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室檢測工作。

1.2 現(xiàn)場調(diào)查2019年4月14日研究室赴發(fā)病牛場進(jìn)行現(xiàn)場調(diào)查。該場犢牛表現(xiàn)為嚴(yán)重的精神沉郁，四肢無力，脫水；7頭犢牛臥地不起；犢牛糞便為黃色、白色、灰色稀糞或綠色糞便,部分給藥后牛糞便為綠色、黃色。5頭牛死亡。對死亡犢牛進(jìn)行剖檢顯示，腸黏膜充血、出血(圖1)，腸系膜淋巴結(jié)腫大，皺胃有大量凝乳塊，胃黏膜出血，易脫落(圖2)。

圖1 腸黏膜充血、出血 圖2 皺胃有大量凝乳塊，胃黏膜出血

1.3 樣本的采集與實(shí)驗(yàn)室檢測采集新發(fā)病而未用藥的犢牛(4頭)、用藥犢牛(3頭)和同群無明顯腹瀉癥狀犢牛(2頭)的血樣及糞樣，血樣用于牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的檢測，糞樣用于多抗原(牛輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌K99和小球隱孢子蟲)的檢測。利用雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒(購自Bio-X公司)對所采集的糞便樣品進(jìn)行多病原檢測，包括牛輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌K99、小球隱孢子蟲4種病原。提取血清中RNA后利用RT-PCR方法對(BVDV)進(jìn)行病原檢測[4]。將糞便樣品接種TSA平皿及麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離。利用PCR對所分離出來的大腸桿菌進(jìn)行K88核酸檢測[5]。

2 結(jié)果

2.1 輪狀病毒檢測77.8%(7/9)的糞樣為輪狀病毒陽性。其中，100%(4/4)的新發(fā)病而未用藥犢牛、33.3%(1/3)的用藥犢牛及100%(2/2)的無明顯腹瀉癥狀犢牛為輪狀病毒抗原檢測陽性，表明該場存在普遍性感染輪狀病毒的情況。11.1%(1/9)的糞便樣品為冠狀病毒抗原及小球隱孢子蟲抗原檢測陽性，且來自于同一頭無明顯腹瀉癥狀犢牛；所有的9份犢牛樣品中均未檢出大腸桿菌K99抗原。在所有的9頭犢牛中，11.1%(1/9)的犢牛為輪狀病毒、冠狀病毒和小球隱孢子蟲混合感染。具體結(jié)果見表1。

2.2 BVDV的檢測9頭犢牛血液樣本中33.3%(3/9)為BVDV陽性，包括1頭用藥犢牛，2頭無明顯腹瀉癥狀犢牛(圖3)，表明該場存在有BVDV的感染。

2.3 大腸桿菌的分離鑒定糞便樣品所涂布的TSA平皿中長出灰白色圓形菌落；麥康凱培養(yǎng)基平皿中長出粉紅色菌落，疑似大腸桿菌。對長出的菌落進(jìn)行16S rRNA測序，結(jié)果顯示所分離的細(xì)菌為大腸桿菌。

表1 9頭犢牛的牛輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌K99、小球隱孢子蟲糞樣病原檢測結(jié)果

圖3 血清樣本中BVDV 病原檢測結(jié)果 M.DL5000 DNA Marker； 1～3.用藥犢牛； 4,5.無明顯腹瀉癥狀犢牛； 6～10.新發(fā)病而未用藥犢牛； 11.陰性對照； 12.陽性對照

2.4 大腸桿菌K88的核酸檢測每個(gè)犢牛樣本挑取2～3個(gè)菌落進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，1頭無明顯腹瀉癥狀犢牛和1頭發(fā)病犢牛糞便樣本出現(xiàn)K88特異性條帶(圖4)。

2.5 藥敏試驗(yàn)用紙片法檢測所分離的大腸桿菌對10種常見藥物的敏感性[6]，結(jié)果顯示大腸桿菌對慶大霉素和卡那霉素敏感，對紅霉素、阿莫西林、四環(huán)素、氟苯尼考、青霉素和環(huán)丙沙星6種藥物耐藥(表2)。

3 討論

牛輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌K99和小球隱孢子蟲是臨床上導(dǎo)致犢牛腹瀉的主要病原[7]，因此在本案例中對該些病原進(jìn)行了抗原檢測。由于輪狀病毒抗原檢測陽性率極高，為77.8%，因此推斷輪狀病毒為導(dǎo)致本場犢牛腹瀉的主要病原。為了解牛場整體的感染情況，我們對無明顯腹瀉癥狀犢牛也進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在無明顯腹瀉癥狀的犢牛中也有該病原的存在；不僅如此，BVDV也存在于無明顯癥狀的犢牛，表明該場同時(shí)存在有輪狀病毒及BVDV的感染。由于各頭犢牛感染期存在有差異，因此臨床癥狀上存在有差別。

圖4 大腸桿菌K88核酸PCR擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker； 1～29.犢牛樣本；30.陰性對照；31.陽性對照

表2 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

此外，出現(xiàn)了多種病原同時(shí)在1頭牛中出現(xiàn)的結(jié)果，表明該場犢牛腹瀉存在有共感染情況，且同時(shí)也不可排除其他病原存在有潛伏感染的情況。另1頭犢牛雖然無明顯腹瀉癥狀，但實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果顯示已經(jīng)感染了輪狀病毒、BVDV和大腸桿菌K88混合感染，需要盡快治療。

目前，國內(nèi)尚無針對牛輪狀病毒的特效藥物和商品化的疫苗。對于牛輪狀病毒感染，主要采取補(bǔ)液措施防脫水，并糾正電解質(zhì)紊亂等非特異性支持療法。可用微生態(tài)制劑飲水，輔助治療，并促進(jìn)胃腸道功能恢復(fù)。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可用慶大霉素、卡那霉素對感染大腸桿菌K88的犢牛進(jìn)行治療，且在治療過程中應(yīng)考慮該病毒的協(xié)同致病作用。

另外也應(yīng)從生物安全和農(nóng)場管理方面給出相關(guān)建議。首先消除傳染源，切斷傳播途徑是重要控制手段，故應(yīng)加強(qiáng)隔離、清潔和消毒等手段；對于腹瀉病犢牛，建議單欄關(guān)養(yǎng)，及時(shí)清除病畜糞便，并進(jìn)行消毒，防止糞便污染食物和飲水，導(dǎo)致傳播；犢牛吃奶前要消毒乳房，防止交叉感染。其次用0.01%碘、1%次氯酸鈉和70%酒精可使病毒喪失感染力，所以也應(yīng)同時(shí)注意對清潔工具的消毒，防止糞中病毒隨清糞工具傳播。最后，也應(yīng)增強(qiáng)牛體抵抗力，增加保溫措施，保持犢牛舍溫暖，及時(shí)更換墊草，保持干燥，保證及時(shí)和充足地飲用初乳和常乳。