仔豬體內(nèi)姜黃素對豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的作用評價(jià)

吳小萍，房軍洋，郭忠義，陳 旭，穆 楊，杜濤峰

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的一種重要的豬傳染病，主要臨床特征是母豬繁殖障礙和各年齡段的豬呼吸系統(tǒng)癥狀。1995年，首次證實(shí)我國豬群中存在PRRSV感染[1]，2006年，我國暴發(fā)了高致病性PRRS，其高發(fā)病率和高死亡率給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重危害[2]?，F(xiàn)階段，PRRSV的2個(gè)基因型(美洲型和歐洲型)在我國都有流行，并且，由于PRRSV進(jìn)化具有高突變的特點(diǎn)，使得新的變異毒株不斷的出現(xiàn)，而且存在嚴(yán)重的混合感染現(xiàn)象，因此，PRRS對我國養(yǎng)豬業(yè)的危害依然存在[3]。雖然自我國首次報(bào)道該病以來，至今流行已有20多年，但目前尚無安全有效的PRRSV疫苗。

姜黃素是一種具有多種生物學(xué)活性的天然化合物，在體外試驗(yàn)已證實(shí)，姜黃素具有抗多種病毒的活性，包括乙型腦炎病毒[4]、丙型肝炎病毒[5-6]、乙型肝炎病毒[7-8]、裂谷熱病毒[9]、呼吸道合胞體病毒[10-12]、Ⅱ型登革熱病毒[13]、基孔肯雅病毒、水泡性口炎病毒[14]、寨卡病毒[15]和流感病毒[16-17]。動(dòng)物試驗(yàn)方面，給H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 AIV)感染的火雞喂食姜黃素與百里香醌，可顯著抑制H9N2 AIV的致病作用[18]，姜黃素可抑制弗云德鼠白血病病毒感染引起的BALB/c小鼠紅白血病病情的發(fā)展[19]。本課題組前期的研究中，已證實(shí)姜黃素在細(xì)胞水平可抑制PRRSV的增殖[20-21]，本研究將進(jìn)一步探討姜黃素在PRRSV感染仔豬中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和試劑Marc-145細(xì)胞在含有100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素(Sigma-Aldrich)和10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng) (biological industries)，培養(yǎng)條件為37℃、5%的CO2和95%的濕度;高致病性PRRSV毒株 HuN4 (GenBank ID:EF635006)在Marc-145細(xì)胞上增殖和滴度測定;姜黃素購自Sigma-Aldrich。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)12頭4周齡PRRSV陰性的健康仔豬隨機(jī)分為3組，每組4頭豬，分別在3個(gè)隔離的房間。第1組為姜黃素治療組，3×105TCID50/頭PRRSV攻毒后，姜黃素拌料喂食，劑量為1 g/(頭·d)；第2組為PRRSV攻毒組；第3組為未攻毒組。每天測量直腸溫度并記錄，于攻毒后3，7，14，21 d收集血清進(jìn)行病毒載量的檢測，攻毒后7，14，21 d的血清用于PRRSV特異性抗體的檢測。

1.3 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit (全式金)提取血清中的PRRSV RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa)說明書反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA后，SYBR?Premix Dimer Eraser(TaKaRa)和qTOWER 2.2(Analytik Jena Life Science)分析PRRSV N基因的表達(dá)。PRRSV N基因特異性引物序列,其中正向引物：5′-AGATCATCATCGCCCAACAAAAC-3′；反向引物：5′-GACACAATTGCCGCTCACTA-3′。

1.4 PRRSV特異性抗體的檢測仔豬血清中PRRSV特異性的抗體應(yīng)用IDEXX PRRS X3 Ab Test進(jìn)行檢測，結(jié)果判定臨界值為0.4。S/P值大于0.4，結(jié)果判定為陽性；S/P值小于0.4，結(jié)果判定為陰性。

1.5 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)于攻毒后14 d，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整至5×106/mL，100 μL/孔鋪板于96孔板，然后每孔加入10 mg/L純化的PRRSV，于37℃、5% CO2和95%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，分光光度計(jì)測定D450 nm值。

1.6 數(shù)據(jù)分析用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，t檢驗(yàn)被用于分析兩組數(shù)據(jù)的差異性。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對PRRSV感染后仔豬直腸溫度的影響從攻毒前2 d開始測量仔豬的直腸溫度并記錄，結(jié)果如圖1所示。攻毒前2 d，15頭豬的直腸溫度都在正常范圍;從攻毒后1 d開始， PRRSV攻毒組和姜黃素治療組仔豬的直腸溫度開始高于未攻毒組;從攻毒后6～11 d，PRRSV攻毒組和姜黃素治療組每頭仔豬的直腸溫度都達(dá)到39.5℃及以上;攻毒后23 d，PRRSV攻毒組和姜黃素治療組仔豬的直腸溫度趨于與未攻毒組一致。結(jié)果表明，姜黃素拌料喂食PRRSV感染后的仔豬，對仔豬直腸溫度升高沒有顯著影響。

圖1 攻毒后仔豬直腸溫度

2.2 姜黃素對PRRSV感染后仔豬病毒血癥的影響收集攻毒后3，7，14，21 d仔豬的血清，通過檢測血清中病毒的拷貝數(shù)，評價(jià)姜黃素對PRRSV感染后仔豬病毒血癥的影響。結(jié)果表明，在攻毒后3，7，14 d，姜黃素治療組與PRRSV攻毒組相比，血清中病毒的拷貝數(shù)無顯著差異(圖2A～C)，而攻毒后21 d，姜黃素治療組血清中病毒的拷貝數(shù)顯著低于PRRSV攻毒組(圖2D)。

圖2 攻毒后3(A)，7(B)，14(C)，21 d(D)仔豬血清中PRRSV載量水平 用t檢驗(yàn)分析法計(jì)算P值;ns代表無顯著差異;*代表P< 0.05

2.3 姜黃素對PRRSV感染后仔豬體內(nèi)PRRSV特異性抗體的影響在PRRSV攻毒后7，14，21 d，收集仔豬血清檢測PRRSV特異性抗體的產(chǎn)生情況。結(jié)果表明，在攻毒后7，14，21 d，PRRSV攻毒組和姜黃素治療組S/P值都大于0.4，檢測結(jié)果都為抗體陽性，在攻毒后14 d，S/P值達(dá)到峰值。與PRRSV攻毒組相比，姜黃素治療組S/P平均值整體都高于PRRSV攻毒組。未攻毒組S/P值都小于0.4，檢測結(jié)果為抗體陰性(圖3)。

2.4 姜黃素對PRRSV特異性淋巴細(xì)胞增殖的影響在PRRSV攻毒后14 d，收集血液，分離外周血單核細(xì)胞，通過CCK-8法檢測姜黃素是否誘導(dǎo)PRRSV特異性的淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，與PRRSV攻毒組相比，姜黃素拌料飼喂PRRSV感染后的仔豬可顯著誘導(dǎo)PRRSV特異性的淋巴細(xì)胞增殖(圖4)。

3 討論

在抗PRRSV研究方面，一些草本提取物具有抗PRRSV的活性。表沒食子兒茶素沒食子酸酯，一種在綠茶中提取的類黃酮化合物，其人工合成的類似物可以抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制[22]。丹參根莖的提取物丹參酮ⅡA可通過抑制PRRSV N基因的表達(dá)和PRRSV誘導(dǎo)的自噬抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中復(fù)制[23]。茶葉中的粗提物茶皂素也可以通過類似丹參酮ⅡA的作用途徑抑制PRRSV的復(fù)制[24]。另外，金銀花抗病毒的主要成分之一綠原酸和主要存在于黃芩中的一種黃酮類化合物黃芩素可通過抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中早期階段的復(fù)制或直接滅活病毒發(fā)揮抗PRRSV的功能[25]。姜黃素為姜黃根的提取物，在體外也表現(xiàn)出良好的抗PRRSV活性[20-21]。雖然，這些草本提取物在體外都具有良好的抗PRRSV活性，但大部分目前都局限于體外研究，是否在體內(nèi)也具有抗PRRSV活性，還需要進(jìn)一步的研究。

圖3 攻毒后7，14，21 d，仔豬血清中PRRSV特異性抗體水平 S/P>0.4，檢測結(jié)果為陽性;S/P<0.4，檢測結(jié)果為陰性

圖4 攻毒后14 d PRRSV特異性淋巴細(xì)胞增殖水平 用t檢驗(yàn)分析法計(jì)算P值( ***代表P< 0.001)

本研究主要探討了姜黃素在PRRSV感染仔豬中的作用，以拌料飼喂的方式給藥，雖然在攻毒后14 d，姜黃素可顯著誘導(dǎo)PRRSV特異性的淋巴細(xì)胞增殖，但不能顯著增強(qiáng)PRRSV特異性抗體的產(chǎn)生，從而使僅在攻毒后21 d，姜黃素可顯著抑制血清中的病毒拷貝數(shù)。在攻毒后3，7，14 d，姜黃素不能抑制血清中的病毒拷貝數(shù)，而且姜黃素也不能降低PRRSV感染引起的體溫升高。依據(jù)姜黃素在嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)生物利用率的特點(diǎn)[26-28]，姜黃素對PRRSV感染仔豬的治療效果不甚理想的原因可能是姜黃素以口服的方式使用，姜黃素在仔豬體內(nèi)的吸收率比較低，而且大部分姜黃素可能會(huì)被機(jī)體迅速清除。

雖然不同的動(dòng)物試驗(yàn)已經(jīng)證明，姜黃素具有較高的安全性，但姜黃素生物利用率低阻止了其在臨床上的應(yīng)用。目前，已有幾種策略被用于增強(qiáng)姜黃素的生物利用率，包括納米顆粒藥物傳遞系統(tǒng)，脂質(zhì)體藥物傳遞系統(tǒng)，可抑制姜黃素新陳代謝的佐劑，可以增強(qiáng)姜黃素胃腸道吸收的膠團(tuán)和磷脂，以及磷脂復(fù)合物技術(shù)[29]。本研究結(jié)果表明，在仔豬體內(nèi)姜黃素對PRRSV感染具有一定的抑制作用，下一步將通過增強(qiáng)姜黃素在豬體內(nèi)的生物利用率，提高姜黃素在豬體內(nèi)對PRRSV感染的治療效果。