新型冠狀病毒獼猴感染實(shí)驗(yàn)生物安全管理

孟軻音，萬(wàn)忠海，李吉平，卜昭陽(yáng)，繆發(fā)明，姚騰，高玉偉，劉軍

軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130122

新型冠狀病毒?。–OVID-19）是繼2003年SARS、2004年禽流感、2014年埃博拉疫情以來(lái)的又一起國(guó)際公共衛(wèi)生事件，目前全球感染人數(shù)不斷攀升，國(guó)際疫情仍未得到有效控制，人類生命健康受到嚴(yán)重威脅，也給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成重大損失。故此，相關(guān)機(jī)構(gòu)陸續(xù)開(kāi)展了新型冠狀病毒檢測(cè)、疫苗研制、防治藥物篩選及致病機(jī)制研究工作。我國(guó)衛(wèi)健委按其危害程度，將SARS-CoV-2歸為二類病原微生物進(jìn)行管理，規(guī)定動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)在動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作[1]。本文結(jié)合生物安全實(shí)驗(yàn)室管理相關(guān)法律法規(guī)及實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，以SARS-CoV-2感染獼猴為例，對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、實(shí)驗(yàn)室類型及關(guān)鍵防護(hù)設(shè)備、人員培訓(xùn)、個(gè)體防護(hù)裝備、人員進(jìn)出流程、獼猴轉(zhuǎn)運(yùn)、獼猴實(shí)驗(yàn)操作、消毒滅菌、意外事故處理等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的生物安全有關(guān)事項(xiàng)進(jìn)行闡述。

1 新型冠狀病毒感染獼猴實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

1.1 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)機(jī)及方式

在開(kāi)展新冠病毒獼猴感染實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)因素，建立風(fēng)險(xiǎn)控制措施，評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別。

本實(shí)驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估由實(shí)驗(yàn)人員與生物安全管理人員共同完成。實(shí)驗(yàn)人員主要側(cè)重生物因子和實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)分析，生物安全管理團(tuán)隊(duì)依據(jù)生物因子特性及擬開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)負(fù)責(zé)設(shè)施設(shè)備、個(gè)體防護(hù)裝備、人員進(jìn)出、消毒滅菌、意外事故等的風(fēng)險(xiǎn)分析。

1.2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估側(cè)重點(diǎn)

SARS-CoV-2可感染人和其他哺乳動(dòng)物，除經(jīng)飛沫和密切接觸傳播外，也有通過(guò)氣溶膠、糞-口及眼結(jié)膜多種途徑傳播的可能。其傳染性強(qiáng)、傳播速度快[2]，加之本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為獼猴，較對(duì)鼠的生物安全管理復(fù)雜很多。因此，我們?cè)诔浞挚紤]此病原特性及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，著重在動(dòng)物飼養(yǎng)操作籠具的設(shè)計(jì)、個(gè)體防護(hù)裝備的選用、動(dòng)物逃逸風(fēng)險(xiǎn)的分析方面進(jìn)行反復(fù)研討，多次論證。

2 實(shí)驗(yàn)室類型及關(guān)鍵防護(hù)設(shè)備

2.1 實(shí)驗(yàn)室類型

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施條件和動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)備不同，ABSL-3分為不同類型，具備開(kāi)展新冠病毒獼猴感染實(shí)驗(yàn)的ABSL-3實(shí)驗(yàn)室包括《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）規(guī)定的4.4.2和4.4.3類實(shí)驗(yàn)室，主要區(qū)別是是否可有效利用安全隔離裝置（如生物安全柜、手套箱式隔離器）操作常規(guī)量經(jīng)空氣傳播致病性生物因子。目前在生物安全實(shí)驗(yàn)室使用的猴飼養(yǎng)隔離器主要有2類，一類是半開(kāi)放式隔離器，另一類是全封閉的手套箱式隔離器。如果采用前者飼養(yǎng)動(dòng)物，須在4.4.3類實(shí)驗(yàn)室工作；如果采用后者飼養(yǎng)動(dòng)物，則在4.4.2類實(shí)驗(yàn)室即可。本實(shí)驗(yàn)室采用手套箱式負(fù)壓隔離器，隔離器符合《實(shí)驗(yàn)室設(shè)備生物安全性能評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（RB/T 199-2015）的要求，因此使用4.4.2類實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展獼猴感染實(shí)驗(yàn)。

2.2 關(guān)鍵防護(hù)設(shè)備

開(kāi)展本實(shí)驗(yàn)涉及的關(guān)鍵防護(hù)設(shè)備，如生物安全柜、雙扉高壓滅菌器、過(guò)氧化氫發(fā)生器均為標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)備，而獼猴負(fù)壓隔離裝置目前缺乏像鼠IVC籠具一樣的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)備。依據(jù)獼猴智力發(fā)達(dá)、攻擊性強(qiáng)、喜抓咬等特點(diǎn)，為了確保獼猴飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的安全性，我們從以下幾方面考慮，設(shè)計(jì)制作了手套箱式獼猴負(fù)壓隔離器：①負(fù)壓隔離器在氣密性及相對(duì)壓差應(yīng)符合《實(shí)驗(yàn)室設(shè)備生物安全性能評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（RB/T 199-2015）的要求；②負(fù)壓隔離器上應(yīng)裝有傳遞窗，以便獼猴及物品的相互傳遞；③負(fù)壓隔離器上應(yīng)安裝獼猴保定用人工推拉式拉桿，以盡可能避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中獼猴對(duì)人員造成傷害；④負(fù)壓隔離器上應(yīng)裝有備用風(fēng)機(jī)，以避免負(fù)壓隔離器故障帶來(lái)生物安全風(fēng)險(xiǎn)；⑤負(fù)壓隔離器上應(yīng)裝有鎖具。

3 培訓(xùn)考核

擬進(jìn)本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展工作的實(shí)驗(yàn)人員，均須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室培訓(xùn)并考核合格。

3.1 人員培訓(xùn)

本實(shí)驗(yàn)室將人員培訓(xùn)分為4個(gè)等級(jí)。一級(jí)主要為生物安全通用環(huán)節(jié)培訓(xùn)，包括生物安全基本知識(shí)、人員進(jìn)出流程、個(gè)體防護(hù)裝備穿脫、廢棄物處理、高壓滅菌、實(shí)驗(yàn)室日常清理及消毒、設(shè)施設(shè)備操作等；二級(jí)在一級(jí)培訓(xùn)的基礎(chǔ)上增加了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)生物安全操作；三級(jí)在二級(jí)培訓(xùn)內(nèi)容的基礎(chǔ)上增加小鼠實(shí)驗(yàn)生物安全操作；四級(jí)在以上三級(jí)培訓(xùn)內(nèi)容外，根據(jù)工作實(shí)際需要增加了大中動(dòng)物（如猴、貂、狗、貓、豬等）生物安全操作。

3.2 人員考核

實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)過(guò)培訓(xùn)后均須接受專家組的考核，考核合格后可獲得實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)等級(jí)證書(shū)，并且實(shí)驗(yàn)室為每一名實(shí)驗(yàn)人員單獨(dú)建立了人員技術(shù)檔案和培訓(xùn)檔案。獲得一級(jí)證書(shū)的人員可作為實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，不得獨(dú)立開(kāi)展實(shí)驗(yàn)；獲得二級(jí)及以上證書(shū)的人員為實(shí)驗(yàn)正式人員，可根據(jù)等級(jí)證書(shū)培訓(xùn)范圍開(kāi)展相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

獲得四級(jí)證書(shū)的人員方可開(kāi)展SARS-CoV-2感染獼猴實(shí)驗(yàn)。且由于新冠病毒是一種新的病毒，對(duì)其了解不充分，因此開(kāi)展相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可能會(huì)遇到新的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除了開(kāi)展常規(guī)的生物安全培訓(xùn)外，還多次組織實(shí)驗(yàn)室管理人員和項(xiàng)目人員集中學(xué)習(xí)研討，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并解決實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在的問(wèn)題，改進(jìn)優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），建立了非常良好的工作交流機(jī)制，為開(kāi)展新冠病毒獼猴感染實(shí)驗(yàn)提供了人員技術(shù)保障。

4 個(gè)體防護(hù)裝備

4.1 個(gè)體防護(hù)裝備的選用

在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常個(gè)體防護(hù)裝備選用雙層防護(hù)服配雙層鞋套，其中內(nèi)層為棉質(zhì)面料，外層為一次性防護(hù)面料，另外還須佩戴雙層手套、護(hù)目鏡和N95口罩。

在SARS-CoV-2感染獼猴實(shí)驗(yàn)中，由于SARS-CoV-2傳染性極強(qiáng)、傳播速度極快等特點(diǎn)，建議面部防護(hù)選用正壓頭罩內(nèi)戴N95口罩替代護(hù)目鏡。對(duì)獼猴進(jìn)行麻醉、免疫、攻毒、采樣、解剖實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)根據(jù)具體情況佩戴防抓咬手套和防割傷手套，用X線對(duì)獼猴進(jìn)行影像檢查時(shí)還應(yīng)穿戴防輻射隔離衣。另外，用雙扉高壓滅菌器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)廢棄物消毒滅菌時(shí)還應(yīng)佩戴防燙傷手套。

4.2 選用時(shí)注意事項(xiàng)

應(yīng)根據(jù)個(gè)人身材特點(diǎn)選擇合適尺碼的防護(hù)服，以增加實(shí)驗(yàn)操作的舒適性，減少暴露風(fēng)險(xiǎn)。一次性防護(hù)服標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合歐標(biāo)EN14126，如需無(wú)菌操作，還應(yīng)符合GB 19082-2012[3-4]。

雙層手套建議選用內(nèi)深外淺的乳膠或丁腈手套，以便在手套破損時(shí)容易識(shí)別。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如外層手套被污染，應(yīng)及時(shí)更換。

5 人員進(jìn)出流程

5.1 一般流程

實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)遵循潔凈區(qū)、半污染區(qū)、污染區(qū)的進(jìn)入原則，退出應(yīng)遵循污染區(qū)、半污染區(qū)、潔凈區(qū)的退出原則。通常將更換潔凈衣物的更衣室劃為潔凈區(qū)，更換防護(hù)服的更衣室、緩沖間和緩沖走廊劃為半污染區(qū)、核心間劃為污染區(qū)[5]。

5.2 特殊流程

在SARS-CoV-2感染獼猴實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)人員往往在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后還要進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，須從一個(gè)核心區(qū)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)核心區(qū)。轉(zhuǎn)移過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)在與核心間相鄰的緩沖間脫掉外層防護(hù)服，在緩沖走廊換上預(yù)先準(zhǔn)備好的一次性防護(hù)服，既而進(jìn)入下一個(gè)核心間。

6 獼猴轉(zhuǎn)運(yùn)

6.1 轉(zhuǎn)運(yùn)包裝物的選擇

獼猴轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)最好選用一次性包裝物，通常采用特制的轉(zhuǎn)運(yùn)籠或雙層生物安全包裝。轉(zhuǎn)運(yùn)包裝物不得隨意帶出，必須經(jīng)雙扉高壓滅菌器高壓后方可轉(zhuǎn)出實(shí)驗(yàn)室。

6.2 轉(zhuǎn)運(yùn)路線

在用獼猴開(kāi)展SARS-CoV-2研究工作時(shí)，須將待養(yǎng)在觀察區(qū)的獼猴轉(zhuǎn)運(yùn)至ABSL-3實(shí)驗(yàn)室核心區(qū)負(fù)壓籠具內(nèi)。根據(jù)獼猴體型特點(diǎn)，一般可從傳遞窗傳入。由于獼猴動(dòng)作敏捷、攻擊力較強(qiáng)，故傳入前應(yīng)先將獼猴麻醉，后經(jīng)輔助區(qū)傳遞窗傳至緩沖走廊，再經(jīng)緩沖走廊傳遞窗傳至核心區(qū)。

6.3 轉(zhuǎn)運(yùn)方法

6.3.1 轉(zhuǎn)運(yùn)人員布局 獼猴轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)應(yīng)在輔助區(qū)、緩沖走廊、核心間即潔凈區(qū)、半污染區(qū)、污染區(qū)分別布設(shè)人員，人員不可逆行，待動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)完畢后，潔凈區(qū)、半污染區(qū)人員方可按流程進(jìn)入核心區(qū)。

6.3.2 傳遞窗的使用 用預(yù)先準(zhǔn)備的75%酒精噴灑傳遞窗周圍，以阻斷傳遞窗內(nèi)可能溢出的病毒粒子，然后打開(kāi)傳遞窗，將帶有外包裝的已麻醉的獼猴放入傳遞窗后關(guān)閉傳遞窗，接著打開(kāi)另外一側(cè)傳遞窗，開(kāi)啟前仍須用75%酒精噴灑傳遞窗周圍，開(kāi)啟后用75%酒精噴灑傳遞窗內(nèi)部，待取出獼猴后關(guān)閉傳遞窗，同時(shí)開(kāi)啟紫外燈照射半小時(shí)，再傳遞下一批實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

7 獼猴實(shí)驗(yàn)操作

7.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

在動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作的新型冠狀病毒獼猴實(shí)驗(yàn)一般包括獼猴麻醉、病毒接種、采血及分離血清、體溫測(cè)量、鼻咽肛拭子采樣、病理解剖等。

7.2 注意事項(xiàng)

①實(shí)驗(yàn)操作須2～3名人員進(jìn)行；②實(shí)驗(yàn)操作均須在獼猴麻醉狀態(tài)下進(jìn)行；③獼猴麻醉應(yīng)在負(fù)壓動(dòng)物飼養(yǎng)箱中進(jìn)行；④實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中始終要觀察獼猴是否有蘇醒跡象，如有蘇醒跡象則對(duì)獼猴進(jìn)行追加麻醉；⑤麻醉用注射器應(yīng)裝入盛有消毒劑的銳器盒內(nèi)消毒，而后裝入雙層生物安全包裝袋內(nèi)雙扉高壓處理；⑥采血收集管應(yīng)為螺口離心管，將血液從注射器推入時(shí)，管口應(yīng)有酒精棉球覆蓋；⑦進(jìn)行獼猴氣管內(nèi)接種病毒，注射器在注入及拔出時(shí)均須通過(guò)酒精棉球；⑧注射器針頭的夾取均須用止血鉗；⑨獼猴尸體的解剖須將尸體按轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)程運(yùn)至負(fù)壓解剖箱中進(jìn)行；⑩實(shí)驗(yàn)用過(guò)的耗材均須放在雙層高壓滅菌袋內(nèi)或放入盛有消毒液的高壓滅菌桶內(nèi)浸泡后雙扉高壓處理。

8 消毒滅菌

根據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委COVID-19相關(guān)指南，酒精、含氯消毒劑、二氧化氯、過(guò)氧化氫、過(guò)氧乙酸對(duì)SARS-CoV-2有較好的殺滅作用，而氯己定對(duì)SARS-CoV-2 無(wú)效[6-7]。

綜合衛(wèi)健委指南、同行推薦及本實(shí)驗(yàn)室消毒劑效果驗(yàn)證，從消毒劑的消毒效果、對(duì)物品的腐蝕性、對(duì)人體的危害程度等多方考量，建議正壓頭罩和主機(jī)外表面選用75%酒精噴灑消毒，外層防護(hù)服及實(shí)驗(yàn)室日常消毒選用1%衛(wèi)可噴灑消毒，生物安全柜日常消毒選用75%酒精噴灑擦拭消毒，需要浸泡消毒的物品采用75%酒精浸泡消毒，如有被血漬污染的的器械可先用新潔爾滅浸泡去污漬，獼猴尸體及其他廢棄物均須雙層包裝、表面消毒后雙扉高壓處理，實(shí)驗(yàn)室終末消毒采用過(guò)氧化氫汽化消毒。

9 意外事故處理

實(shí)驗(yàn)室意外事故有多種類型，本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)人員意外傷害、感染性物質(zhì)濺灑、儀器設(shè)備故障、動(dòng)物逃逸、火災(zāi)及自然災(zāi)害等意外事故，均制備了完善的意外事故處置預(yù)案。下面僅就與此實(shí)驗(yàn)特性相關(guān)的意外事故處理加以簡(jiǎn)單描述。

9.1 獼猴抓咬傷

獼猴天性好動(dòng)、抓咬能力強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一定要避免此類現(xiàn)象的發(fā)生。如意外發(fā)生獼猴抓咬傷，應(yīng)立即停止工作，在同事配合下按程序消毒傷口退出實(shí)驗(yàn)室，到醫(yī)學(xué)觀察室隔離觀察，觀察自覺(jué)癥狀，定期檢測(cè)核酸。如懷疑有感染癥狀，應(yīng)立即到定點(diǎn)醫(yī)院就醫(yī)，如無(wú)自覺(jué)癥狀，定期核酸檢測(cè)均為陰性，2周后可解除隔離。同時(shí)，報(bào)告生物安全負(fù)責(zé)人，填寫(xiě)《意外事故處理記錄》。

9.2 獼猴逃逸

因?yàn)楂J猴處于清醒狀態(tài)時(shí)始終被鎖于負(fù)壓隔離器內(nèi)，故發(fā)生逃逸的可能性極小。ABSL-3實(shí)驗(yàn)室門處于互鎖狀態(tài)，即使獼猴發(fā)生逃逸，也不會(huì)逃出實(shí)驗(yàn)室。但為了避免意外發(fā)生，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)備有專業(yè)麻醉槍，一旦發(fā)生獼猴逃逸，可利用麻醉槍對(duì)其抓捕。

面對(duì)國(guó)際頻發(fā)的公共衛(wèi)生事件、日趨復(fù)雜的生物安全問(wèn)題，我國(guó)大力加強(qiáng)高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室建設(shè)力度，有效提高了突發(fā)疫情的應(yīng)對(duì)能力和處置能力，但仍須在更高層次統(tǒng)籌生物安全管理，總結(jié)國(guó)內(nèi)外管理方法的差距，健全國(guó)家生物安全管理體系，建立國(guó)產(chǎn)化防護(hù)裝備和產(chǎn)品的各類標(biāo)準(zhǔn)。