基于MALDI-TOF MS技術子宮內膜癌血清學診斷模型的建立及驗證

吳艷花 ，孫克娜 ，劉曉斐 ，王佳

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院 a.檢驗科；b.衛(wèi)勤部；山東 濟南 250031

［關鍵字］ 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）；子宮內膜癌；診斷模型；腫瘤標記物

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是發(fā)生于子宮的惡性上皮性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。近年來，國內外EC的發(fā)病率不斷升高，并有年輕化的趨勢[1]。EC早期癥狀多無特異性，常表現(xiàn)為不規(guī)則陰道出血和排液等。EC晚期多存在腹膜后淋巴結轉移，治療效果及預后欠佳，但Ⅰ期低危型EC患者術后5年存活率可高達80%～93%[2]，因此早診斷、早治療對提高EC治愈率降低死亡率有重大意義。臨床上EC的早期診斷主要依賴經(jīng)陰道B超、診斷性刮宮和宮腔鏡下組織活檢等有創(chuàng)檢查，血清學標志物CA125和HE4診斷EC的特異性不高，目前尚缺乏敏感性、特異性的血液學評價指標。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（ma?trix-assisted laserdesorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種高通量、高靈敏度及高特異性的新型軟電離生物質譜分析技術，操作簡便方便無創(chuàng)，可廣泛應用于基因突變檢測、基因多態(tài)性研究、微生物鑒定、腫瘤生物學標志物檢測等方面。弱陽離子交換磁珠（weak cation-exchange chromatography mag?netic beads，MB-WCX）對血清中低豐度蛋白有較好的富集能力，我們擬通過MB-WCX聯(lián)合MAL?DI-TOF MS技術，檢測EC患者血清和子宮內膜良性病變患者血清中的蛋白表達、分析差異蛋白，篩選出EC患者和子宮良性病變血清中差異表達的蛋白質/肽，建立EC診斷預測模型，以期為EC的早期篩查及輔助診斷提供新的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年6月至2020年6月就診于解放軍第九六〇醫(yī)院的EC患者血清標本53例，年齡54.96±9.01歲，中位年齡55歲；病理類型腺癌51例，腺癌伴鱗狀上皮化生2例；根據(jù)子宮內膜癌國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期（2009）標準，ⅠA期24例（肌層浸潤<1/2），ⅠB期15例（肌層浸潤≥1/2），Ⅱ/Ⅲ期8例（浸潤宮頸間質）。高/中分化43例，低分化8例?；颊呔?jīng)術后病理初次確診為子宮內膜癌，未經(jīng)過放化療及抗癌藥物治療，無其他腫瘤等惡性病史。收集同期就診的子宮內膜良性病變患者（非典型增生、單純增生、息肉）血清標本37例，年齡47.41±10.32歲，中位年齡50歲；其中子宮內膜非典型增生患者19例、子宮內膜單純增生患者10例、子宮內膜息肉患者8例。所有標本均在患者入院后接受手術、治療前收集；所有入組者均排除子宮之外其他部位腫瘤、嚴重出血、急性或慢性感染、自身免疫性疾病病史。

1.2 血清蛋白的提取

采集晨起空腹靜脈血4 mL，分離血清，-80℃保存。實驗前將凍存的標本逐步復融（-20℃放置8 h，4℃直至標本融化）。采用Bruker公司MBWCX試劑盒提取蛋白質/多肽。為保證結果的一致性，所有標本同時復融，同時進行蛋白提取。

1.3 MALDI-TOF MS檢測

取1 μL提取的蛋白樣品點樣于AnchorChip靶板上，干燥后取1 μL新鮮配置的基質（6 mg HCCA，50% CAN，2% TFA）點于樣品點上，室溫干燥后上機。應用FlexControl軟件檢測，檢測靈敏度 5，優(yōu)化范圍 m/z為 1000～10 000 Da，激光強度為70%，每個樣品點累積轟擊100×10次。所有標本均進行復孔點樣。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用ClinProTools 3.0和FlexAnalysis軟件。經(jīng)基線去除、平滑、歸一化等處理，剔除小于1000 Da的峰，以排除基質峰干擾。對信噪比（S/N）>5的峰做統(tǒng)計分析，計算2組中差異蛋白的平均峰下面積和平均峰值強度。差異蛋白的統(tǒng)計分析采用遺傳算法（GA），選擇差異最顯著的2個峰分別為x、y軸做聚類分析和ROC曲線分析，建立診斷模型。將所有標本按2∶1隨機分組，訓練組60例（EC患者35例，良性病變25例），驗證組30例（EC患者18例，良性病變12例）；用訓練組建立診斷模型，用驗證組驗證診斷模型的敏感性、特異性及診斷效率。

2 結果

2.1 2組血清蛋白質圖譜比較分析

ClinProTools軟件分析發(fā)現(xiàn)2組指紋圖譜峰值強度存在明顯差異，分析范圍為1000～10 000 Da，共得到124個差異峰，具有統(tǒng)計學差異的蛋白峰47個（P<0.05），聯(lián)合ROC曲線分析篩選出AUC>0.80的差異峰14個，差異表達情況見表1。其中EC組表達上調的蛋白有7個，m/z分別為2482.62、2661.8、2863.7、2953.39、3242.22、5906.2、6091.35 Da；EC組表達下調的蛋白有7個，m/z分別為 1692.5、1779.63、1866.76、2211.14、7924.86、8142.99、9433.76 Da。m/z為 1779.63和 1866.76 Da的2個蛋白峰差異性最顯著（圖1），ROC曲線分析 AUC分別為 0.935和0.969，且EC組m/z 1779.63和1866.76 Da的平均峰下面積明顯低于良性病變組（圖2）。

2.2 EC診斷模型的建立及驗證

ClinProTools軟件分析數(shù)據(jù)，用訓練組（60例）指紋圖譜建立GA模型。分別以m/z 1779.63和1866.76 Da為x、y軸進行聚類分析，結果顯示2組血清標本基本無交叉，可顯著區(qū)分EC患者和良性疾患者，交叉驗證能力為93.77%，識別能力為96.43%。將驗證組（30例）指紋圖譜導入診斷模型進行驗證，結果顯示驗證組中18例EC患者正確判斷16例（圖3A），驗證組中12例良性病變患者正確判斷11例（圖3B），則該診斷模型的敏感性88.89%，特異性為91.67%，診斷效率為90%。

3 討論

目前EC的診斷主要依賴于影像學和組織病理學。經(jīng)陰道超聲檢測方便、無創(chuàng)，是EC早期篩查、診斷的首選方法，但診斷的靈敏度和特異性易受子宮內膜厚度的影響。據(jù)報道，陰道超聲檢測EC及其癌前病變的靈敏度/特異度分別為87.5%/80.1%[3]。診斷性刮宮術是診治子宮內膜異常的經(jīng)典術式，其診斷EC和非典型增生的靈敏度可達83.75%[4]，但該操作為盲視操作，若遺漏病灶則耽誤病情；此外其為有創(chuàng)性檢查，患者疼痛負荷大，選用時須綜合考慮。

表1 EC組和良性病變組血清蛋白表達情況分析

圖1 2組患者血清蛋白指紋圖譜（峰值強度）

圖2 差異蛋白峰下面積及ROC曲線

圖3 GA診斷模型及驗證結果

較為常用的婦科腫瘤標志物如CA125和HE4在診斷子宮內膜疾病方面并不具優(yōu)勢。Jiang等[5]發(fā)現(xiàn)CA125雖在EC患者血清中升高，但不能單獨用于EC的診斷?？梢娔壳癊C的早期篩查、診斷仍然缺乏安全、有效、特異的方法。因此，尋找新的早期篩查診斷的血清學指標尤為迫切。

MALDI-TOF MS作為精準醫(yī)學發(fā)展的先進技術，無須蛋白純化，少量樣本即可直接快速、高通量分析多種生物學信息，進行潛在標志物的篩選、鑒定，已廣泛用于卵巢癌[6]、肝癌[7]、肺癌[8]、腦腫瘤[9]等多種腫瘤標志物的篩選和鑒定。MBWCX表面積大，吸附能力強，可以選擇性富集、純化低豐度蛋白和多肽，與MALDI-TOF-MS技術聯(lián)合應用，為篩選高敏感性、特異性的潛在血清學標志物提供了一個新技術平臺。

本研究應用MB-WCX對EC患者和良性病變血清中低豐度蛋白進行富集，然后通過MALDITOF MS技術篩選出m/z為1779.63和1886.76 Da的2種顯著差異蛋白，ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)2種蛋白在診斷EC和子宮內膜良性疾病上價值較高，AUC分別為0.935和0.969。以這2種蛋白建立的診斷模型診斷EC和良性病變的敏感性和特異性分別可達88.89%和91.67%，診斷效率為90%。Dong等[10]在CA125和HE4聯(lián)合診斷EC研究中指出，2種指標聯(lián)合檢測診斷EC的敏感性為73.2%，ROC曲線分析AUC為0.819。另外，Huang等[11]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，CA125和HE4聯(lián)合應用診斷EC的敏感性和特異性分別為66%和92%，AUC為0.86。與之相比，本研究建立的診斷模型有較高的敏感性和診斷效率，提示該診斷模型可用于輔助診斷、鑒別診斷EC和子宮內膜不典型增生。

有研究表明，50%未經(jīng)治療的子宮內膜非典型增生患者將于10年內發(fā)展為EC[12]。因此，有學者推薦在具有EC高危因素的無癥狀人群中進行EC及癌前病變的早期篩查，但目前尚無特異的血清學篩查指標。本實驗選取初診的EC患者和子宮內膜良性病變患者進行研究，共篩選出14個顯著差異表達的蛋白峰，與子宮內膜非典型增生患者相比EC患者血清中表達上調和下調的各有7個。其中m/z為1779.63和1886.76 Da的蛋白差異最為顯著，有望成為EC及癌前病變早期篩查、鑒別診斷的潛在腫瘤標記物。

綜上所述，本研究建立的EC血清學診斷模型有較高的敏感性和特異性，適用于具有EC高危因素的無癥狀人群及癌前病變的早期篩查和輔助診斷。篩選出的2個差異蛋白有望成為EC早期篩查、診斷的潛在腫瘤標記物。但差異蛋白尚須通過液相串聯(lián)質譜技術進一步鑒定，以明確其生物學特性及在EC發(fā)病中的作用機制。本實驗由于樣本量有限，結果可能存在偏倚。后續(xù)研究中將進一步擴大樣本量，細化分組，并結合臨床病理特征進行深入分析。