網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶體外抑制作用的研究

馮學(xué)珍，覃慧逢，馮書珍

（廣西科技大學(xué)，廣西柳州545006）

糖尿病是一種由胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏引起的慢性代謝紊亂性疾病，它的特點(diǎn)是血糖過高，碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝紊亂，是一個(gè)全球健康問題[1]。臨床上將糖尿病分為幾種類型，其中Ⅱ型糖尿病患者占90%以上，表現(xiàn)為餐后高血糖，這可能與葡萄糖攝取或糖原分解或糖異生作用有關(guān)。因此，葡萄糖攝取可能是一個(gè)治療靶點(diǎn)，抑制α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，EC 3.2.1.20）的活性，延緩食物中碳水化合物分解轉(zhuǎn)化為葡萄糖，減少葡萄糖的吸收從而降低餐后血糖濃度[2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑作為治療Ⅱ型糖尿病的有效藥物，越來越受到人們的青睞[3-5]。

海藻多糖是一類多組分的混合物，因其來源于海洋，加之海藻多糖具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性，成為目前海洋藥物研究的熱點(diǎn)之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)，海藻中普遍含有能抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質(zhì)[7]，如海藻脂溶性提取物、海藻多酚等[8-9]。網(wǎng)地藻（Dictyota dichotoma）是褐藻門、褐藻綱、網(wǎng)地藻目、網(wǎng)地藻科、網(wǎng)地藻屬的一種海洋藻類。廣西北部灣地處亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，岸線曲折，深水條件好，其沿海三市存在食用、藥用藻類品種繁多[10]。其中褐藻門（Phaeophyta）中研究較少的網(wǎng)地藻，當(dāng)?shù)鼐用裨糜诏彴X、腳氣及腸炎的治療。目前關(guān)于網(wǎng)地藻的研究主要集中于對(duì)其化學(xué)成分、抑菌、抗氧化等活性的研究，其它領(lǐng)域研究相對(duì)較少[11-13]。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)網(wǎng)地藻多糖的降糖活性進(jìn)行了初步研究，為開發(fā)天然α-葡萄糖苷酶抑制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的網(wǎng)地藻采自廣西北部灣海域，經(jīng)大連海洋大學(xué)邢坤副教授鑒定為鹿角網(wǎng)地藻（Dictyota cervicornis），經(jīng)反復(fù)水洗、干燥、粉碎后備用。

4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶 （α-Glucosidase）：Sigma 公司，阿卡波糖（阿卡波糖≥99.5%）、對(duì)硝基苯酚（4-Nitrophenol，pNP≥99.5%）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：麥克林試劑公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan GO 酶標(biāo)儀、Nicolet 6700 傅立葉紅外光譜儀：美國熱電公司；EYELA N-1300v-WB 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、UV-2600 紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；DL-180J 智能超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司；FD-1C-50 冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；PHS-25 酸度計(jì)：上海虹益儀器儀表有限公司；AL104 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 網(wǎng)地藻多糖樣品的制備

參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行，將干燥后的網(wǎng)地藻粉末（5 g）乙醇浸泡過夜揮干，加 30 倍（150 mL）蒸餾水，在75 ℃，pH 7.0 的條件下超聲（功率200 W）輔助水提取30 min，離心除去濾渣，上清液減壓濃縮，80%無水乙醇醇沉，Sevage 法脫蛋白，活性炭脫色，醇沉，乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌，干燥即得網(wǎng)地藻多糖的樣品。

1.3.2 pNP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用蒸餾水準(zhǔn)確配制系列濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L）的 pNP 標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取pNP 標(biāo)準(zhǔn)溶液 10 μL、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液 90 μL、0.2 mol/L Na2CO3100 μL 于 96 孔板中，振蕩混勻 30 s，測(cè)定其 405 nm 處吸光度（OD405），以 pNP 溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（OD405）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

無色的底物PNPG 在α-葡萄糖苷酶作用下可水解釋放出在堿性條件下顯黃色的pNP，pNP 在405 nm處有最大吸收，因此通過測(cè)定405 nm 處的吸光度反應(yīng)水解生成的pNP 濃度。參照文獻(xiàn)[14]描述的方法，稍作修改，利用PNPG 為底物建立網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用體外模型。

一定質(zhì)量濃度的網(wǎng)地藻多糖溶液按每孔50 μL 加入酶標(biāo)板，每組設(shè)三復(fù)孔，另設(shè)藥物對(duì)照孔、空白對(duì)照孔及空白反應(yīng)孔。藥物對(duì)照孔加50 μL pH 6.8 的磷酸緩沖液，藥物反應(yīng)孔加50 μL 的0.45 U/mL 酶振蕩30 s 后于 37 ℃孵育 10 min，之后加 100 μL PNPG（5 mmol/L）振蕩30 s 后 37 ℃反應(yīng) 20 min，最后加 100 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，在 405 nm 處測(cè)定吸光度（OD）值，按下式計(jì)算網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率[15]。

式中：A1為藥物反應(yīng)孔吸光度值；A2為藥物對(duì)照孔吸光度值；A3為空白反應(yīng)孔吸光度值；A0為空白對(duì)照孔吸光度值。

1.3.4 網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

1.3.4.1 反應(yīng)pH 值對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響

精確配制50 mg/mL 的網(wǎng)地藻多糖溶液按上述

1.3.3 的抑制作用測(cè)定方法，在溫度37 ℃、反應(yīng)時(shí)間20 min、反應(yīng)pH 值（6.0、6.4、6.8、7.2、7.4）的條件下進(jìn)行抑制作用測(cè)定，考察pH 值與抑制作用的關(guān)系。

1.3.4.2 反應(yīng)溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響

精確配制50 mg/mL 的網(wǎng)地藻多糖溶液在1.3.4.1確定的反應(yīng)pH 值條件下，在反應(yīng)時(shí)間20 min，溫度（27、32、37、42、47 ℃）的條件下按 1.3.3 的抑制作用測(cè)定方法進(jìn)行抑制作用測(cè)定，考察反應(yīng)溫度與抑制作用的關(guān)系。

1.3.4.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響

精確配制50 mg/mL 的網(wǎng)地藻多糖溶液，按1.3.3的抑制作用測(cè)定方法，在1.3.4.1 確定的反應(yīng)pH 值條件下，在1.3.4.2 確定的反應(yīng)溫度下，在反應(yīng)時(shí)間（10、20、30、40、50 min）的條件下進(jìn)行抑制作用測(cè)定，考察反應(yīng)時(shí)間與抑制作用的關(guān)系。

1.3.4.4 網(wǎng)地藻多糖質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響

取一定質(zhì)量濃度的網(wǎng)地藻多糖溶液（1、5、10、15、20、25、30、40、50 mg/mL）按上述 1.3.3 的抑制作用測(cè)定方法，在1.3.4.1 確定的反應(yīng)pH 值條件下，在1.3.4.2確定的反應(yīng)溫度下，1.3.4.3 確定的反應(yīng)時(shí)間的條件下進(jìn)行抑制作用測(cè)定，考察網(wǎng)地藻多糖的質(zhì)量濃度與抑制作用的關(guān)系。

1.3.5 網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型試驗(yàn)

在1.3.4 優(yōu)化的條件下，在網(wǎng)地藻多糖濃度（0、15、30 mg/mL），反應(yīng)時(shí)間為6 min，測(cè)定網(wǎng)地藻多糖溶液在不同底物濃度（0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L）下對(duì)α-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)速率，以底物濃度倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖分析，按式（2）（3）計(jì)算米氏常數(shù)Km和酶促反應(yīng)最大速率Vmax，確定抑制類型[16]。

式中：V 為反應(yīng)速率（μmol/L·min）；[S]為底物濃度（μmol/L）；Vmax為酶促反應(yīng)最大速率（μmol/L·min）；Km為米氏常數(shù)（mmol/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

pNP 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。

由圖1 可知，在0.01 mmol/L～0.08 mmol/L 在范圍內(nèi)，吸光度與pNP 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與呈正相關(guān)，結(jié)果見圖 1，其線性關(guān)系為：y=9.734 8x+0.223 4（R2=0.994 3）。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試驗(yàn)條件下所用α-葡萄糖苷酶的活力為0.45 U/mL。

圖1 pNP 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 pNP standard curve

2.2 網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)pH 值對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響

每一種酶都有其作用的最佳pH 值，pH 值對(duì)酶活反應(yīng)的影響較大。反應(yīng)pH 值對(duì)抑制作用的影響見圖2。

圖2 反應(yīng)pH 值對(duì)抑制作用的影響Fig.2 The effect of pH on inhibitory efficiency

由圖2 可知，網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著反應(yīng)pH 值的增加抑制率逐漸增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)pH 值達(dá)到6.8 之后，抑制率逐漸減弱。每一種酶都有其作用的最適pH 值，α-葡萄糖苷酶作用最適pH 值偏中性，本試驗(yàn)確定的網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用pH 值為6.8，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[17]。

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)網(wǎng)地藻多糖抑制作用的影響

反應(yīng)溫度對(duì)抑制作用的影響見圖3。

由圖3 可知，網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著反應(yīng)溫度的增加抑制率先增強(qiáng)后減弱，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，抑制率達(dá)到最大值，之后溫度繼續(xù)升高，抑制率卻有下降趨勢(shì)，可能是溫度升高，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的原因。后續(xù)抑制作用試驗(yàn)的反應(yīng)溫度為 37 ℃。

圖5 網(wǎng)地藻多糖質(zhì)量濃度對(duì)抑制作用的影響Fig.5 The effect of inhibitor concentration on inhibitory efficiency

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)網(wǎng)地藻多糖抑制作用的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)抑制作用的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)抑制作用的影響Fig.4 The effect of reaction time on inhibitory efficiency

由圖4 可知，網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著反應(yīng)時(shí)間的增加抑制率逐漸增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到20 min 之后，抑制率增加逐漸減慢，抑制曲線趨于平緩，可能是20 min 之后抑制劑與酶的作用已趨于飽和的原因。后續(xù)抑制作用試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間為20 min。

2.2.4 網(wǎng)地藻多糖質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

網(wǎng)地藻多糖質(zhì)量濃度對(duì)抑制作用的影響見圖5。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)抑制作用的影響Fig.3 The effect of temperature on inhibitory efficiency

由圖5 可知，網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著網(wǎng)地藻多糖濃度的增加抑制率逐漸增強(qiáng)，當(dāng)網(wǎng)地藻多糖濃度達(dá)到40 mg/mL 之后，抑制率增加逐漸減慢，抑制曲線趨于平緩，可能是抑制劑與酶的結(jié)合已趨于飽和的原因。后續(xù)試驗(yàn)網(wǎng)地藻多糖溶液的質(zhì)量濃度采用40 mg/mL。對(duì)除最后一點(diǎn)之外的點(diǎn)進(jìn)行線性回歸（以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)）得回歸方程為：y=2.164 3x+1.002 3（R2=0.991 4），計(jì)算其IC50約為：22.64 mg/mL。利用PNPG 為底物建立酶—抑制劑體外模型，在反應(yīng)pH 值為6.8，反應(yīng)溫度為37 ℃、時(shí)間20 min 的條件下網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，有望將其開發(fā)為α-葡萄糖糖苷酶抑制劑。

2.3 網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型的確認(rèn)

在網(wǎng)地藻多糖濃度（0、15、30 mg/mL），反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)pH 值為6.8，反應(yīng)時(shí)間為6 min 的條件下，測(cè)定網(wǎng)地藻多糖溶液在不同底物濃度下對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制情況。抑制作用的雙倒數(shù)圖見圖6。

圖6 抑制作用的雙倒數(shù)圖Fig.6 Double reciprocal plot of inhibition

由圖 6 可知，在 3 個(gè)不同濃度（0、15、30 mg/mL）的網(wǎng)地藻多糖存在下，α-葡萄糖苷酶對(duì)PNPG 酶促反應(yīng)的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖呈線性關(guān)系，其直線為相交于第二象限的直線，該抑制類型屬于混合型抑制[18]。網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

由表1 的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，隨著網(wǎng)地藻濃度的不斷增加，其抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km逐漸增加，Vmax逐漸減少，這符合可逆的混合I 型抑制類型[19-20]。

表1 網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of alpha-glucosidase inhibited by Dictyota dichotoma polysaccharides

3 結(jié)論

研究表明，多糖是海藻中主要的生物活性成分，是一類分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子天然化合物，因其來源于海洋，故具有其他天然多糖無法比擬的藥理活性，受到廣大學(xué)者的高度關(guān)注[21]。李龍[22]對(duì)壇紫菜多糖和龍須菜多糖的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明這兩種多糖均具有刺激免疫細(xì)胞分泌炎性因子的作用。鄧志峰等[23]研究了龍須菜多糖和扁江蘺多糖的抗腫瘤活性，結(jié)果表明，這兩種瓊膠型多糖均能起到抑制腫瘤生長的作用。Zhang 等[24]研究了南海7 種海藻多糖的抗病毒活性，結(jié)果表明7 種海藻多糖對(duì)單純皰疹病毒 1 型（HSV-1）和柯薩基病毒 B3（CoxB3）均表現(xiàn)出抗病毒活性。初步的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，關(guān)于海藻多糖的藥理活性的研究大都集中在抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫條件等方面，關(guān)于海藻多糖具有降糖藥理作用的研究較少，本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上[25]，采用對(duì)-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（PNPG）為底物建立的酶-抑制劑體外篩選模型，研究了網(wǎng)地藻多糖的降糖作用。

網(wǎng)地藻多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的大小會(huì)受到反應(yīng)pH 值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及網(wǎng)地藻多糖質(zhì)量濃度的影響，在反應(yīng)pH 值為6.8、反應(yīng)溫度為37 ℃、反應(yīng)時(shí)間為20 min 的條件下網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，其IC50為：22.64 mg/mL。抑制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明網(wǎng)地藻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型抑制。結(jié)果表明網(wǎng)地藻多糖具有一定的降糖作用，其IC50約為：22.64 mg/mL。同等試驗(yàn)條件下，標(biāo)準(zhǔn)品阿卡波糖的IC50為：11.45 mg/mL[26]，雖然網(wǎng)地藻多糖的降糖作用達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)品阿卡波糖的降糖效果，但是網(wǎng)地藻在我國屬于藥食同源的海藻，可將其作為治療或輔助治療糖尿病的藥物或保健品，為今后開發(fā)以網(wǎng)地藻多糖為主的藥食兩用型α-葡萄糖苷酶抑制劑提供理論依據(jù)，本文的研究結(jié)果還可為進(jìn)一步開發(fā)廣西北部灣海洋藥用資源奠定基礎(chǔ)。