正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取果蔬中赤霉素GA3殘留量的測(cè)定條件

王健，任雪梅，丁曉雯

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250102；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715）

赤霉素GA3（gibberellic acid）又名赤霉酸、九二O、奇寶，是一種生物活性高、應(yīng)用廣泛的植物激素類農(nóng)藥。1926 年，日本科學(xué)家黑澤英一在研究水稻“惡苗病”時(shí)發(fā)現(xiàn)感染赤霉菌（Gibberella fujikuroi）的水稻植株會(huì)出現(xiàn)瘋長(zhǎng)現(xiàn)象，后來經(jīng)分離鑒定這種活性物質(zhì)被命名為赤霉素[1-2]。迄今為止，已先后鑒定出136 種結(jié)構(gòu)明確的赤霉素GA1～GA136，其中GA3的生物活性最高、應(yīng)用最廣泛。赤霉素作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，在促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)、種子萌發(fā)、莖稈伸長(zhǎng)、根的生長(zhǎng)及開花、果實(shí)發(fā)育以及提高植物耐逆性等方面發(fā)揮著重要作用[3-5]。

國(guó)內(nèi)外研究表明，赤霉素GA3急性毒性較低，對(duì)大鼠具有一定的遺傳毒性[6]、神經(jīng)毒性[7]及生殖毒性[8]，可引起肝臟損傷[9]，甚至誘發(fā)腫瘤的形成[10-11]。對(duì)于赤霉素GA3的殘留限量問題世界各國(guó)未達(dá)成一致結(jié)論，日本肯定列表規(guī)定的赤霉素GA3最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）為 0.2 mg/kg[12]，我國(guó)還未制定赤霉素的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，因此檢測(cè)該物質(zhì)在農(nóng)產(chǎn)品與食品中的殘留量，對(duì)了解它對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的污染情況、保護(hù)消費(fèi)者健康具有積極意義。

目前測(cè)定赤霉素的前處理方法主要有液-液萃取[13-14]、固相萃取[15-17]、基質(zhì)分散固相萃取[18-20]，此外還有超聲波輔助提取[21]、大孔吸附樹脂[22]等方法。部分測(cè)定方法前處理操作步驟繁瑣，不適合農(nóng)殘的快速檢測(cè)，而國(guó)標(biāo)方法GB 23200.21-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)水果中赤霉酸殘留量的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[23]僅適用于水果中赤霉素殘留量的測(cè)定。本研究采用超聲波提取-固相萃取-液相色譜法檢測(cè)果蔬中赤霉素GA3的殘留量，目的是簡(jiǎn)化前處理步驟，提高赤霉素的提取效率，為保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆芽、梨、蘋果、葡萄、黃瓜：重慶市北碚區(qū)A 超市；李子、番茄、黃豆芽：重慶市北碚區(qū)B 超市；圣女果、生菜、青椒：重慶市北碚區(qū)C 市場(chǎng)。其中單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、驗(yàn)證試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)采用黑豆芽；加標(biāo)回收試驗(yàn)、樣品測(cè)定采用黃豆芽。

赤霉素GA3標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（分析純）、甲酸（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠；甲醇（色譜純）：天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；0.45 μm 有機(jī)系微孔濾膜：廣州華載試劑耗材公司；C18固相萃取小柱（3 mL，200 mg）：北京超能傳奇公司。

1.2 儀器設(shè)備

LC-20A 型高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）、SHIMADZU C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：日本SHIMADZU 公司；KQ5200DB 型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；HGC-36A 型氮吹儀：天津市恒奧科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 赤霉素GA3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用甲醇作溶劑，配制0.1 mg/mL赤霉素GA3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存于4 ℃冰箱中，有效期3 個(gè)月。將赤霉素GA3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成濃度依次為 0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光保存于 4 ℃冰箱中，有效期1 個(gè)月。

色譜條件[24]：SHIMADZU C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），甲醇-0.15%甲酸水溶液（55 ∶45，體積比）作流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5.0 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為 206 nm。

在上述色譜條件下，對(duì)各濃度的赤霉素GA3標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定。以赤霉素GA3的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制赤霉素GA3標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。

1.3.2 樣品的前處理

參照文獻(xiàn)[25]，稱取搗碎后的樣品10 g 左右于100 mL 藍(lán)蓋玻瓶中，加入 20 mL 甲醇-水（80 ∶20，體積比）溶液，超聲波提取30 min，布氏漏斗抽濾，取1.0 mL濾液于45℃氮吹至近干，用5%甲醇溶液定容至1.0 mL，過C18固相萃取小柱（小柱使用前分別用1 mL 甲醇和1 mL 純水活化），用 3 mL 甲醇-水（40 ∶60，體積比）洗脫。收集洗脫液于45 ℃氮吹至近干，用甲醇（色譜純）定容至1.0 mL，過0.45 μm 濾膜，供液相色譜分析。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程查出測(cè)定液中赤霉素GA3的濃度，計(jì)算樣品中赤霉素GA3的含量。計(jì)算公式如下：

式中：X 為樣品中赤霉素的含量，mg/kg；C 為樣品測(cè)定液中赤霉素的含量，μg/mL；F 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 影響樣品前處理的單因素試驗(yàn)

以黑豆芽作為試驗(yàn)樣本，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間 30 min、超聲功率 160 W、料液比 1 ∶2（g/mL）及甲醇濃度80%為基本條件，改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以考察這4 個(gè)因素對(duì)黑豆芽中赤霉素GA3提取量的影響，確定最佳試驗(yàn)條件。其中超聲時(shí)間分別設(shè)為 10、20、30、40、50 min，超聲功率分別設(shè)為 96、112、128、144、160 W，料液比分別設(shè)為 1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5（g/mL），甲醇濃度分別設(shè)為 60%、70%、80%、90%、100%。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)超聲時(shí)間、超聲功率、料液比、甲醇濃度這4 個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化前處理?xiàng)l件，并根據(jù)正交試驗(yàn)得出的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表的設(shè)置見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels used in the orthogonal array design

1.3.5 精密度及加標(biāo)回收試驗(yàn)

用正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件對(duì)樣品進(jìn)行提取，提取液重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差即精密度；在所測(cè)樣品中加入一定量的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算回收率。

1.3.6 市售果蔬中赤霉素GA3殘留量的檢測(cè)

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后的樣品前處理?xiàng)l件對(duì)梨等5 種水果及番茄等5 種蔬菜中的赤霉素GA3進(jìn)行提取純化，并利用液相色譜法測(cè)定其殘留量。在各樣品中分別添加0.1、0.5、1.0 mg 赤霉素GA3標(biāo)準(zhǔn)品，分別計(jì)算低、中、高3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)均重復(fù)操作3 次以上，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析（最小顯著性差異法）。采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素GA3的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

在試驗(yàn)方法給定的色譜條件下，測(cè)定并計(jì)算得到赤霉素GA3標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0～100 μg/mL，檢出限（S/N=3）為0.5 μg/mL。赤霉素GA3（95%）標(biāo)準(zhǔn)曲線、標(biāo)準(zhǔn)溶液（40 μg/mL）色譜圖分別見圖 1、圖2。

圖1 赤霉素GA3（95%）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gibberellic acid（95%）

圖2 赤霉素GA3 標(biāo)準(zhǔn)溶液（40 μg/mL）色譜圖Fig.2 Chromatogram of gibberellic acid standard solution（40 μg/mL）

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

超聲波輔助提取技術(shù)利用超聲效應(yīng)使提取液充分滲透到樣品勻漿中，具有提取溫度低、耗時(shí)短、效率高等特點(diǎn)，適用于各種動(dòng)、植物有效成分的提取[26]。固相萃取技術(shù)利用固體吸附劑對(duì)不同組分吸附能力的差異而達(dá)到分離待測(cè)組分的目的，是一種有效的樣品前處理方法。對(duì)于提取劑的選擇，考慮到樣品基質(zhì)為含水量較多的水果蔬菜，應(yīng)選擇與水互溶的有機(jī)溶劑作為提取劑。參照文獻(xiàn)[25]的試驗(yàn)結(jié)論，60%甲醇溶液提取效果較差，純甲醇提取時(shí)易發(fā)生乳化現(xiàn)象，因此選用80%甲醇溶液作為提取劑。本試驗(yàn)采用超聲波提取、固相萃取相結(jié)合的方法對(duì)豆芽中赤霉素GA3進(jìn)行提取純化，優(yōu)化提取條件，以達(dá)到更好的提取效果。

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)赤霉素GA3提取量的影響

稱取一定量搗碎的黑豆芽樣品，加入80%甲醇溶液，于超聲功率 160 W、料液比 1 ∶2（g/mL）的條件下超聲處理不同的時(shí)間，然后抽濾、過C18固相萃取小柱，進(jìn)液相色譜分析，得到不同超聲時(shí)間對(duì)黑豆芽中赤霉素GA3測(cè)定值的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)赤霉素GA3 提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on the amount of gibberellic acid

由圖3 可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間在40 min 以內(nèi)，赤霉素GA3的提取量增加差異不顯著，當(dāng)超聲時(shí)間超過40 min，赤霉素GA3的提取量與其他時(shí)間的提取量存在顯著性差異。結(jié)果表明，超聲時(shí)間的延長(zhǎng)有助于溶劑提取樣品中的赤霉素GA3，但是考慮到省時(shí)的原則，超聲時(shí)間選擇50 min。

2.2.2 超聲功率對(duì)赤霉素GA3提取量的影響

稱取一定量搗碎的黑豆芽樣品加入80%甲醇溶液，在不同的超聲功率下維持料液比1 ∶2（g/mL）、超聲時(shí)間30 min 處理樣品，然后抽濾、過C18固相萃取小柱，進(jìn)液相色譜分析，得到不同超聲功率對(duì)黑豆芽中赤霉素GA3測(cè)定值的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對(duì)赤霉素GA3 提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the amount of gibberellic acid

由圖4 可以看出，當(dāng)超聲功率為144 W 時(shí)，赤霉素GA3的提取量達(dá)到最大值，且128、144 W 的超聲功率對(duì)赤霉素GA3的提取量與其他功率相比存在顯著性差異；當(dāng)超聲功率超過144 W，由于超聲波可能對(duì)赤霉素GA3有一定的分解，導(dǎo)致赤霉素GA3的提取量顯著降低。因此，超聲功率選擇144 W。

2.2.3 料液比對(duì)赤霉素GA3提取量的影響

稱取一定量搗碎的黑豆芽樣品加入不同體積的80%甲醇溶液，在超聲時(shí)間30 min、超聲功率160 W的條件下提取樣品，然后抽濾、過C18固相萃取小柱，進(jìn)液相色譜分析，得到不同料液比對(duì)黑豆芽中赤霉素GA3測(cè)定值的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對(duì)赤霉素GA3 提取量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the amount of gibberellic acid

由圖 5 可知，當(dāng)料液比為 1 ∶4（g/mL）時(shí)，樣品中赤霉素 GA3的提取量達(dá)到最高，且 1 ∶4、1 ∶5（g/mL）的料液比對(duì)赤霉素GA3的提取量與其他比例存在顯著性差異。因此，料液比選擇 1 ∶4、1 ∶5（g/mL）較合適。基于少用有機(jī)溶劑的原則，選擇料液比為1 ∶4（g/mL）。

2.2.4 甲醇濃度對(duì)赤霉素GA3提取量的影響

稱取一定量搗碎的黑豆芽樣品加入不同濃度的甲醇溶液，在超聲時(shí)間30 min、超聲功率160 W、料液比 1 ∶2（g/mL）的條件下提取樣品，然后抽濾、過 C18固相萃取小柱，進(jìn)液相色譜分析，得到不同濃度的甲醇溶液對(duì)黑豆芽中赤霉素GA3測(cè)定值的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 甲醇濃度對(duì)赤霉素GA3 提取量的影響Fig.6 Effect of methanol concentration on the amount of gibberellic acid

由圖6 可知，當(dāng)甲醇濃度為80%時(shí)，樣品中赤霉素GA3的提取量達(dá)到最高，且80%、90%甲醇溶液對(duì)樣品中赤霉素GA3的提取量顯著高于其他濃度甲醇溶液。因此，甲醇濃度選擇80%、90%較合適?；谏儆糜袡C(jī)溶劑的原則，選擇甲醇濃度為80%。

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，超聲波處理樣品提取赤霉素GA3較適宜的條件是超聲時(shí)間50 min、超聲功率144 W、料液比 1 ∶4（g/mL）、甲醇濃度 80%。

2.3 正交試驗(yàn)確定赤霉素GA3提取的最佳條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表的設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal array

極差R 的大小可衡量因素的主次，極差大表明該因素對(duì)試驗(yàn)的產(chǎn)生與結(jié)果影響大，即此因素重要；極差小表明該因素較次要。由表2 的極差分析結(jié)果可知，各試驗(yàn)因素對(duì)赤霉素GA3測(cè)定含量影響的主次順序?yàn)锽>C>D>A，即超聲功率>料液比>甲醇濃度>超聲時(shí)間；最佳提取條件為A1B1C3D3，即超聲時(shí)間45 min、超聲功率128 W、料液比1 ∶4.5（g/mL）、甲醇濃度85%。

采用優(yōu)化后的超聲波提取條件，經(jīng)固相萃取純化，高效液相色譜法檢測(cè)黑豆芽樣品中赤霉素GA3，得到測(cè)定值為285.19 mg/kg，明顯高于正交試驗(yàn)的最優(yōu)組（第7 組）的208.49 mg/kg。

因此，測(cè)定樣品中赤霉素GA3的超聲波提取的最優(yōu)條件是超聲時(shí)間45 min、超聲功率128 W、料液比1 ∶4.5（g/mL）、甲醇濃度 85%。

2.4 方法的精密度和準(zhǔn)確度

精密度反映分析方法或測(cè)量系統(tǒng)存在的隨機(jī)誤差，是衡量方法可靠性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。黑豆芽樣品精密度試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，其中SD 為標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation），RSD 為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation）。

表3 豆芽樣品精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Accuracy test results of bean sprouts

由表3 可知，黑豆芽樣品赤霉素GA3重復(fù)測(cè)定6次試驗(yàn)的結(jié)果在119.70 mg/kg～130.90 mg/kg 之間，平均值為125.55 mg/kg。因選用不同批次的黑豆芽樣品進(jìn)行正交試驗(yàn)及精密度試驗(yàn)，正交試驗(yàn)最優(yōu)組合與精密度實(shí)驗(yàn)中赤霉素GA3的測(cè)定結(jié)果不具有可比性。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）越接近0%，表示該方法的精密度越好。由表3 可知，黑豆芽中赤霉素提取量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.99%，表明該方法在重復(fù)性條件下（n=6）精密度良好。

準(zhǔn)確度是反映分析方法或測(cè)定系統(tǒng)存在的系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差的綜合指標(biāo)，通常用加標(biāo)回收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。黃豆芽中赤霉素3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率如表4 所示。

表4 豆芽中赤霉素GA3 的加標(biāo)回收率Table 4 Recovery rate of gibberellic acid in bean sprouts

回收率越接近100%，表示該方法的準(zhǔn)確度越高。從表 4 可知，添加 0.1、0.5、1.0 mg 赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)回收率分別為96.04%、97.05%、94.69%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.22%、6.61%、4.65%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

歐盟對(duì)食品中農(nóng)藥殘留測(cè)定方法作了嚴(yán)格規(guī)定，回收率為70%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過20%[27]。經(jīng)驗(yàn)證，本研究所建立的赤霉素殘留檢測(cè)方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍內(nèi)，證明該方法的精密度及準(zhǔn)確度良好，符合分析檢測(cè)的要求。

2.5 市售果蔬中赤霉素GA3殘留檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)購(gòu)買3 個(gè)市場(chǎng)的10 種果蔬樣品，采用優(yōu)化后的超聲波提取條件處理樣本，經(jīng)C18固相萃取小柱凈化，高效液相色譜法測(cè)定，得到樣本中赤霉素GA3含量及3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表5。

由表5 可知，測(cè)定的黃豆芽中赤霉素殘留量高達(dá)21.56 mg/kg，梨、圣女果、蘋果、黃瓜樣品中的殘留量分別為 5.25、4.94、4.57、3.89 mg/kg，其余樣品未檢出。測(cè)定結(jié)果表明，芽菜類和早熟果蔬中GA3殘留情況嚴(yán)重，與史玉琴[28]的結(jié)論一致。

表5 市售果蔬中GA3 殘留量Table 5 Residues of gibberellic acid in commercially available fruits and vegetables

由于我國(guó)未出臺(tái)赤霉素GA3的限量標(biāo)準(zhǔn)，如果套用日本肯定列表規(guī)定的殘留限量0.2 mg/kg，所檢測(cè)的10 種樣品中50%陽(yáng)性檢出均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了0.2 mg/kg，其中黃豆芽中的赤霉素GA3含量超過日本肯定列表的限量規(guī)定100 倍。造成赤霉素GA3殘留量過高的原因可能與不規(guī)范使用有關(guān)，相關(guān)部門應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中赤霉素GA3規(guī)范使用的管理及殘留量的檢測(cè)。

采用本研究所建立的超聲波輔助提取-固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定10 種果蔬樣本赤霉素殘留量，3 個(gè)不同添加水平（0.1、0.5、1.0 mg） 的回收率在79.36%～97.05%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.63%～9.99%。根據(jù)歐盟及我國(guó)相關(guān)規(guī)定，該方法的精密度及準(zhǔn)確度良好，符合檢測(cè)的技術(shù)要求，可以作為果蔬樣本中赤霉素殘留量的測(cè)定方法。

3 結(jié)論

采用超聲波提取樣品中的赤霉素GA3，最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件為超聲時(shí)間45 min、超聲功率128 W、料液比1 ∶4.5（g/mL）、甲醇濃度85%。超聲波提取不僅簡(jiǎn)化了前處理過程，大大縮短了分析時(shí)間，而且測(cè)定的加標(biāo)回收率為79.36%～97.05%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.63%～9.99%。本研究所建立的前處理方法符合簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求，適用于多種果蔬中赤霉素的殘留檢測(cè)。