齊墩果酸和熊果酸提取、分離與測(cè)定方法研究進(jìn)展

付亞玲，高琳，張東旭，張敏，鄭振佳，張仁堂，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018；2.龍大食品集團(tuán)有限公司，山東煙臺(tái)265231）

齊墩果酸，又名土當(dāng)歸酸，存在于190 余種植物中，分子式為C30H18O3，白色針狀結(jié)晶，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿等[1]。熊果酸，又稱烏索酸，分子式為C30H48O3，易溶于乙醇、甲醇、氯仿等，不溶于水和石油醚[2]，存在于60 余種植物中。齊墩果酸和熊果酸互為同分異構(gòu)體，都是弱酸型五環(huán)三萜類化合物，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 齊墩果酸和熊果酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of oleanolic acid and ursolic acid

齊墩果酸和熊果酸以游離或與糖結(jié)合成苷的形式廣泛存在于自然界[3]。齊墩果酸和熊果酸具有低的細(xì)胞毒性和廣泛的生物活性，如保肝、抗炎、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫、降血糖和降血脂等[4-7]。齊墩果酸的抗癌活性具有毒副作用小和安全型高等特點(diǎn)，熊果酸具有美白和抗氧化功能被廣泛的應(yīng)用在化妝品領(lǐng)域。齊墩果酸和熊果酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在人工合成過程中步驟較繁瑣，目前主要為從天然植物中提取再精制得到[8]。本文對(duì)近年來齊墩果酸和熊果酸提取、分離及含量測(cè)定方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，為不同植物中齊墩果酸和熊果酸的相關(guān)研究和開發(fā)利用提供參考。

1 提取方法

1.1 傳統(tǒng)提取方法

1.1.1 回流提取法

回流提取法常用乙醇作為提取溶劑，該方法操作簡單、方便，但具有消耗大量溶劑、操作麻煩等缺點(diǎn)[9]。黃小云等[10]考察了乙醇濃度、料液比、回流溫度、回流時(shí)間對(duì)毛葡萄釀酒皮渣中齊墩果酸提取效果的影響，通過正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件為：95%的乙醇，料液比 1 ∶35（g/mL），回流溫度 35 ℃，回流時(shí)間 45 min。劉剛等[11]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了乙醇回流提取鎖陽熊果酸工藝條件，結(jié)果得出影響熊果酸提取率的各因素大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間＞液料比，最佳工藝條件：80%乙醇、提取溫度78 ℃、提取時(shí)間 1.6 h、料液比 14 ∶1（g/mL）、提取 2 次，熊果酸提取率97.72%。黎海彬[12]通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了回流法提取山楂中熊果酸條件，結(jié)果表明：最佳提取工藝是固液比 1 ∶10（g/mL），90%乙醇，提取時(shí)間 2.5 h，提取溫度80 ℃，該工藝下熊果酸浸出率達(dá)1.07%。周康[13]用傳統(tǒng)乙醇回流法在回流溫度95℃，按料液比1 ∶9（g/mL），回流時(shí)間90 min 條件下提取齊墩果酸，其得率達(dá)到0.34%。

1.1.2 浸提法

浸提法是較常用的提取方法，按照相似相溶的原理把目標(biāo)物從植物中提取出來，此方法簡單易行但耗時(shí)長[9]。郭梅等[14]利用乙醇為浸提劑提取山楂中熊果酸，通過正交試驗(yàn)分析其各因素對(duì)熊果酸提取率的影響大小為：乙醇濃度＞提取溫度＞浸提時(shí)間＞料液比，最佳浸提工藝參數(shù)：乙醇濃度90%、浸提溫度80 ℃、料液比 1 ∶30（g/mL）、浸提時(shí)間 2 h 時(shí)，熊果酸得率 0.262%。王志等[15]用浸提法提取木瓜中齊墩果酸和熊果酸，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，結(jié)果得出最佳參數(shù)：95%乙醇，溫度60 ℃，提取時(shí)間3 h，提取2 次，齊墩果酸和熊果酸料液比分別為1 ∶8（g/mL）和 1 ∶6（g/mL），得率分別為 0.59%和 0.12%。張海泉等[16]以浸提法研究了料液比，提取溫度，提取時(shí)間，乙醇濃度4 個(gè)因素對(duì)苦丁茶熊果酸提取的影響，確定了工藝參數(shù)為液料比為17 ∶1（g/mL）、乙醇濃度為83%、提取溫度83 ℃時(shí)提取率最佳，其中料液比對(duì)熊果酸得率影響最大。

1.2 新型提取法

1.2.1 超聲波輔助提取

超聲波輔助提取是超聲波通過介質(zhì)時(shí)使它們膨脹進(jìn)而產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)、空化作用和熱效應(yīng)破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)來提高得率的方法[17]。孫協(xié)軍等[18]用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波輔助提取山楂中熊果酸和齊墩果酸，結(jié)果表明最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積90%，液固比35 ∶1（mL/g），功率 352 W，提取時(shí)間 4.6 min，齊墩果酸和熊果酸含量為2.87 mg/g。Xia 等[19]研究了超聲波輔助提取女貞子中齊墩果酸和熊果酸，結(jié)果表明最佳提取條件為：95%乙醇，料液比為 1 ∶20（g/mL），超聲溫度40 ℃，提取時(shí)間10 min，在此條件下齊墩果酸和熊果酸得率分別為（6.3±0.25）mg/g 和（9.8±0.30）mg/g，且各因素對(duì)熊果酸提取率影響比齊墩果酸顯著。羅小芳等[20]在單因素基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取宣木瓜齊墩果酸和熊果酸的工藝參數(shù)，得出影響齊墩果酸和熊果酸得率的3 個(gè)因素順序是：超聲時(shí)間＞乙醇濃度＞超聲功率，最佳提取工藝條件為：乙醇濃度95%，超聲時(shí)間3.8 min、超聲功率440 W，齊墩果酸和熊果酸總得率為4.03 mg/g。和傳統(tǒng)提取方法相比，超聲波輔助提取法具有提高齊墩果酸和熊果酸效率，縮短提取時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。

1.2.2 微波輔助提取

微波是利用頻率介于300 MHz 和300 GHz 之間的電磁波的熱效應(yīng)促使細(xì)胞壁破裂來釋放出細(xì)胞內(nèi)有效成分以提取齊墩果酸和熊果酸的方法[9]。Vetal 等[21]用微波輔助提取羅勒葉中熊果酸和齊墩果酸，在微波功率 272 W、提取時(shí)間 3 min 時(shí)，料液比 1 ∶30（g/mL）最佳條件下，齊墩果酸和熊果酸提取率分別達(dá)到86.76%和89.64%，與超聲輔助和浸提相比，微波輔助提取具有時(shí)間短和效率高等優(yōu)點(diǎn)。蔚波等[22]研究了微波輔助提取木瓜渣中齊墩果酸的工藝，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，結(jié)果顯示在微波功率200 W，料液比1 ∶8（g/mL），乙醇濃度70%，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間30 min 的條件下齊墩果酸的提取量為2.712 mg/g。汪文浩等[23]分別對(duì)比微波輔助法、熱回流提取法、超聲波輔助法提取枇杷花中齊墩果酸和熊果酸，其結(jié)果顯示微波輔助法比其他方法提取率高，其最佳工藝為：80 %乙醇，液固比 40 ∶1（mL/g），時(shí)間 50 min，溫度 50℃，微波功率300 W，齊墩果酸和熊果酸提取量分別為0.482 mg/g 和3.118 mg/g。

1.2.3 酶解輔助提取

酶解輔助提取法的原理是酶解可以破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并將組織分解，從而提高提取率[24]，常用的酶有果膠酶、纖維素酶和蛋白酶等。張輝[25]用纖維素酶對(duì)木瓜中齊墩果酸進(jìn)行提取，運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)以提高齊墩果酸得率，試驗(yàn)所得最佳酶解條件為：酶解pH 5.0，酶添加量0.3 %，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間為2 h，該條件下齊墩果酸得率達(dá)3.7 mg/g。張明等[26]比較了纖維素酶、果膠酶以及纖維素酶和果膠酶聯(lián)合作用提取苦丁茶中熊果酸，結(jié)果表明單純的纖維素酶提取效果最優(yōu)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定最合適的工藝參數(shù)：酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間2.5 h，酶量6 mg/g，酶解pH 5.2，熊果酸提取率為1.26%。

2 分離純化方法

齊墩果酸和熊果酸分離純化方法主要有大孔樹脂吸附法、離子交換樹脂法和硅膠柱色譜法等[27]。大孔吸附樹脂、離子交換樹脂和硅膠柱色譜分離原理分別為物理吸附可選擇性的吸附分離提純物質(zhì)、可交換基團(tuán)與溶液中各種離子間依據(jù)不同離子交換能力進(jìn)行分離純化和利用各組分吸附或溶解性能的不同進(jìn)行目標(biāo)化合物的分離純化[28-29]。黃新蘋等[30]對(duì)比AB-8、HPD-100、D-101 3 種型號(hào)的大孔樹脂對(duì)女貞子中齊墩果酸分離純化效果，試驗(yàn)表明AB-8 與D-101 樹脂分離純化效果好。張俊等[31]先運(yùn)用靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)，篩選出AB-8 和HPD100 型兩種最優(yōu)樹脂，并得出樹脂質(zhì)量比為1 ∶2 時(shí)純化扁桃果皮熊果酸效果最佳，再通過響應(yīng)面法優(yōu)化純化工藝得出在上樣液濃度0.31 mg/mL，上樣液 pH 5.01，上樣液流速 1.0 mL/min；洗脫液濃度90%，洗脫液pH 5.06，洗脫液流速1.0 mL/min條件下熊果酸的純度由6.35%提升到32%。楊裕啟等[32]用凝膠型陰離子交換樹脂純化齊墩果酸，在樹脂粒度100 目、吸附和洗脫溫度30 ℃、洗脫液乙醇體積為80%最佳純化條件下，女貞子中齊墩果酸純度達(dá)98%以上。李釤等[33]采用乙醇浸提法提取山楂熊果酸和齊墩果酸后，用硅膠柱色譜分離純化，用石油醚-丙酮（體積比5 ∶1）洗脫，分段收集，熊果酸和齊墩果酸含量達(dá)92%。

3 含量測(cè)定

關(guān)于齊墩果酸和熊果酸的測(cè)定方法早期有報(bào)道紫外分光光度法[34]，但此方法紫外吸收很弱，處于檢測(cè)器邊緣，靈敏度不高。目前常采用的測(cè)定方法有：高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等[35-36]。周曉英等[37]建立了反相高效液相色譜法測(cè)定6 種新疆紅棗中齊墩果酸和熊果酸含量，結(jié)果顯示齊墩果酸平均含量為 310.4 μg/g，熊果酸為 244.1 μg/g。Park 等[38]應(yīng)用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定木瓜中熊果酸含量，采用C-4 柱，以0.1%三氟乙酸的乙腈-水流動(dòng)相梯度洗脫，得出熊果酸的平均含量為0.364%～0.557%。Ma等[39]以BATES 為衍生劑，建立了高效液相液相色譜-熒光-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定紫堇屬植物齊墩果酸含量的方法，結(jié)果表明在灰綠黃堇植物中沒有檢測(cè)出齊墩果酸含量，其余3 種紫堇屬植物中齊墩果酸在根、莖、葉、花中總含量分別為（25.5±4.59）、（47.74±4.27）、（133.99±6.73）、（76.62±5.87）μg/g。張軍等[40]以對(duì)硝基苯甲酰氯為衍生劑，用柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定了牛膝齊墩果酸平均含量為0.19%。李成等[41]采用高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）檢測(cè)棗中齊墩果酸和熊果酸含量，通過精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)得出齊墩果酸和熊果酸平均含量為 84.42 μg/g 和 3.67 μg/g。Chen 等[42]用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定山茱萸、女貞子、山楂等九種草藥熊果酸與齊墩果酸平均含量為0.007 mg/g～6.957 mg/g 和 0.004 mg/g～5.963 mg/g，其檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分別為 0.005 μg/mL 和 0.020 μg/mL。張穎等[43]應(yīng)用毛細(xì)管電泳法分析了齊墩果酸和熊果酸在南蛇藤不同部位中的分布，結(jié)果顯示齊墩果酸和熊果酸在根、莖、皮、葉中的含量分別為 0.256 1、0.674 8、0.519 0、0.183 2 mg/g 和0.372 0、0.158 8、0.109 7、0.067 7 mg/g。

4 總結(jié)與展望

齊墩果酸和熊果酸是許多植物的有效成分，具有廣泛的生物活性和低毒性等特點(diǎn)，尤其是抗癌和抗腫瘤功效，在保健品、食品和藥品方面將會(huì)有廣闊發(fā)展的前景。從目前的研究發(fā)展來看，存在的問題主要有：齊墩果酸和熊果酸結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和藥理活性相近，對(duì)于同時(shí)含齊墩果酸和熊果酸的植物而言很難分離；紫外吸收較弱，檢測(cè)困難，因此高靈敏度檢測(cè)方法的建立十分必要；齊墩果酸和熊果酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，國內(nèi)外主要從植物中提取，后期進(jìn)行化合物的合成和深度開發(fā)利用具有重要潛力價(jià)值。