南極磷蝦中氟的賦存形態(tài)及分析方法研究進展

沙鷗，劉華，鮑佳琦，崔博文，陳麗，王志，覃干景

（1.江蘇海洋大學化學工程學院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院（連云港），江蘇連云港222005；3.江蘇海洋大學海洋生命與水產(chǎn)學院，江蘇連云港222005；4.江蘇深藍遠洋漁業(yè)有限公司，江蘇南通226100）

南極磷蝦（Euphausia superba），又名大磷蝦或南極大磷蝦，是一種小型的海洋浮游蝦狀甲殼類動物。南極磷蝦在南極生態(tài)系統(tǒng)中處于中心位置，是初級生產(chǎn)者和頂端捕食者之間的橋梁。南極磷蝦生物量約為6.5 億噸～10 億噸，是地球上最豐富的動物物種之一，也是人類重要的后備蛋白庫[1-2]。南極磷蝦具有高蛋白、低脂肪、含有人體所必需的全部氨基酸等特點，吸引了一些國家對南極磷蝦進行規(guī)?；纳虡I(yè)捕撈，并對南極磷蝦保鮮、生物活性物質(zhì)提取、蝦油、蝦膏、蝦糜及蝦粉的加工工藝等進行了研究[3-6]。由于南極磷蝦具有廣闊的應(yīng)用前景，我國研究者也加大了對南極磷蝦的研究[7-11]。

盡管南極磷蝦富含蛋白質(zhì)與多種微量元素，有研究發(fā)現(xiàn)該類蝦中氟含量極為豐富，且蝦殼（包括甲殼和尾足）＞頭胸部＞肌肉，南極磷蝦各部分氟含量如表1所示。高氟含量不僅制約了南極磷蝦的加工與安全利用，也限制了南極磷蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[12-14]。各國研究者近年來陸續(xù)對南極磷蝦中氟的賦存形態(tài)與含量進行了研究[15-18]。由于生物體對不同形態(tài)氟化物吸收存在差異，對生物體產(chǎn)生的毒性也不盡相同，故僅檢測蝦中氟元素的總量并不能作為評價其安全性的指標。本文系統(tǒng)闡述了國內(nèi)外文獻報道的南極磷蝦中氟的賦存形態(tài)、南極磷蝦及其產(chǎn)品中氟的前處理方式以及分析檢測方法，為南極磷蝦中的氟的賦存形態(tài)與含量檢測提供一定的科學依據(jù)與理論基礎(chǔ)，為南極磷蝦的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

表1 南極磷蝦的各部位氟的含量（干重）Table 1 Fluorine content of various parts of antarctic krill（dry weight）

1 南極磷蝦中氟的形態(tài)

化學形態(tài)分析是對元素的各種存在形式，包括游離態(tài)、共價結(jié)合態(tài)、絡(luò)合配位態(tài)、超分子結(jié)合態(tài)等進行定性和定量的分析[21]。關(guān)于南極磷蝦中氟的賦存形態(tài)，研究者有按不同的樣品前處理方式對氟進行形態(tài)劃分，也有研究者將土壤中氟的形態(tài)分類直接應(yīng)用于南極磷蝦中氟的形態(tài)分析研究。

根據(jù)樣品的前處理方式不同，研究者對氟的形態(tài)劃分存在多種方式。潘建明等[15]以10%KOH 甲醇溶液（甲醇∶水=9 ∶1，體積比））為提取液對南極磷蝦粉中的氟進行提取，提取液經(jīng)加熱消解，將氯仿萃取、活性炭吸附及濾紙吸附的消解液中的氟統(tǒng)歸納為有機氟，水相中氟為無機氟，并提出南極磷蝦中有機態(tài)氟是以弱結(jié)合態(tài)的形式存在，無機態(tài)氟主要是以鈣磷無機鹽Ca5（PO4）3F 形式存在。曹明秀等[22]分別以鹽酸與水（1 ∶11，體積比）和去離子水為提取液對冷凍南極磷蝦的氟進行浸提，把鹽酸浸提液中的氟稱為總氟，去離子水中氟稱為游離態(tài)氟，除游離態(tài)氟以外的統(tǒng)稱為結(jié)合態(tài)氟。韋強等[23]采用去離子水對南極磷蝦粉進行浸提，并將水提液中氟稱為水溶性的氟。張倩[24]對南極磷蝦油進行低溫碳化與高溫灰化樣品前處理后，將灰化殘留物中的氟稱為總氟。李紅艷[25]對南極磷蝦酶解液進行離心與濾膜分離預(yù)處理，濾液中的氟用0.1 mol/L 高氯酸進行浸提，并將高氯酸浸提液中的氟稱為總氟，具體分類如表2 所示。

吳衛(wèi)紅等[30]采用Tisser 逐級連續(xù)提取法把土壤中的氟分為水溶態(tài)氟、可交換態(tài)氟、鐵錳結(jié)合態(tài)氟、有機態(tài)束縛氟以及殘渣態(tài)氟。趙曉君等[16]采用該分類法對南極磷蝦中的氟進行賦存形態(tài)研究（表3），并發(fā)現(xiàn)水溶態(tài)氟和可交換態(tài)氟具有較強的遷移和轉(zhuǎn)化特性，對生物體具有較高的有效性；該課題組采用離子選擇電極法對南極磷蝦粉中氟的賦存形態(tài)進行定量研究[31]，發(fā)現(xiàn)人體可吸收的水溶態(tài)氟和可交換態(tài)氟占南極磷蝦體內(nèi)總氟含量的都較低，該結(jié)果為南極磷蝦的食用安全性評價提供了理論依據(jù)。

表2 南極磷蝦氟的前處理Table 2 Pretreatment of antarctic krill fluoride

2 南極磷蝦樣品前處理方法

由于南極磷蝦中氟的存在形式多樣化，故對不同形態(tài)氟進行測定前需對樣品進行預(yù)處理。目前文獻報道南極磷蝦中氟的前處理方法有灰化-蒸餾法、水浸提法、酸浸提法等。

表3 南極磷蝦氟的形態(tài)分類[16]Table 3 Morphological classification of fluoride in antarctic krill

灰化-蒸餾法是一種較為經(jīng)典的樣品前處理方法[26]，可用于南極磷蝦及其副產(chǎn)品中總氟含量測定。南極磷蝦樣品用硝酸鎂與氫氧化鈉浸泡，浸泡液經(jīng)低溫碳化與高溫灰化后，在酸性條件下蒸餾，用氫氧化鈉溶液吸收蒸餾出的氟化物，而后對無機態(tài)氟離子進行檢測。朱碧英等[20]采用此法對南極磷蝦全蝦中氟進行提取，采用氟試劑比色法測得總氟含量為1 220 mg/kg，但該法操作繁瑣，敞開式的體系容易導(dǎo)致氟損失。

水浸提法是直接采用去離子水對蝦樣品中氟進行浸提，提取液中的氟被稱為水溶性氟。韋強等[23]采用料液比 1 ∶60（g/mL），浸提溫度 65 ℃，超聲時間 40 min作為提取南極磷蝦水溶性氟的最佳條件，測得水溶性氟的含量為（435±5）mg/kg。

酸浸提法是指采用不同無機酸對蝦中的氟進行浸提的方法，目前文獻報道的主要鹽酸浸提與高氯酸浸提兩種。鹽酸浸提法操作簡單，直接于蝦樣品中加入1 mol/L 鹽酸進行浸提，提取出的氟稱為酸溶性氟，盛曉風等[29]采用該法對蝦肉中氟進行浸提，測得氟含量為419.8 mg/kg；高氯酸浸提與鹽酸浸提的不同之處是高氯酸浸提法不僅可以提取酸溶性氟，還可提取南極磷蝦體內(nèi)弱結(jié)合態(tài)的有機態(tài)氟[15]，李紅艷等[25]采用該法檢測南極磷蝦酶解液氯化鈣法脫氟前后氟含量，經(jīng)氯化鈣沉淀法南極磷蝦酶解液中氟離子質(zhì)量濃度由 66.6 mg/L 降至 8.3 mg/L。

3 南極磷蝦中氟的檢測技術(shù)

3.1 氟離子選擇電極法

氟離子選擇電極法的原理是氟化鑭對氟離子產(chǎn)生選擇性的對數(shù)響應(yīng)，氟電極和飽和甘汞電極在被測試液中產(chǎn)生電位差，根據(jù)能斯特方程計算出溶液中氟離子濃度[26]。氟離子選擇電極法（ion selective electrode ISE）因其選擇性好、適用范圍寬、快速準確、操作簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點[32-34]，成為目前氟離子測定的最經(jīng)典方法。

Soevilk 等[19]首次發(fā)現(xiàn)南極磷蝦富氟特性，并采用氟離子選擇電極法測得南極磷蝦總氟含量為2 400 mg/kg，此后各國學者[4，35-36]采用該法陸續(xù)開展南極磷蝦中富氟特性的研究工作。1991 年張海生等[37]以氟離子選擇電極法測得南極磷蝦總氟含量為1 232 mg/kg，且蝦體內(nèi)氟存在形式主要以鈣磷無機鹽，而非Buchholz[38]報道的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)。由于南極磷蝦中氟含量較高，對于國標氟離子選擇電極法測氟需對樣品稀釋50～100 倍后方可測定，稀釋過程加大了試驗誤差。盛曉風等[29]對國標法GB/T5009.18-2003《食品中氟的測定》-氟離子選擇電極法進行改良，分別吸取低濃度（10.0 μg/mL）、中濃度（100.0 μg/mL）以及高濃度（1 000.0 μg/mL）氟標準液代替了國標中1.0 μg/mL 氟標準溶液，將標準曲線的線性范圍由 0.02 μg/mL～0.2 μg/mL 擴展至0.04 μg/mL～50.0 μg/mL，減小對于南極磷蝦這種高氟產(chǎn)品檢測的誤差。趙彥玲等[28]對用國標氟離子選擇電極法測南極磷蝦中氟含量的數(shù)據(jù)進行處理，發(fā)現(xiàn)試驗數(shù)據(jù)精密度低，因此從加大取樣量和采用標準溶液添加法繪制標準曲線這兩方面進行優(yōu)化。由于南極磷蝦體內(nèi)氟含量分布不均，加大取樣量可以提高樣品的代表性，提高試驗精密度。標準溶液添加法是連續(xù)添加200 μL 的1.0 mg/mL 氟標準溶液，分別計算對應(yīng)溶液的濃度，代替國標法分別吸取不同體積的氟標準液繪制標準曲線，減小試驗誤差、時間及試劑。

3.2 分光光度法

氟試劑比色法的原理是無機態(tài)氟離子（F-）與氟試劑（茜素氨羧絡(luò)合劑）、硝酸鑭在酸性條件下反應(yīng)生成藍色三元絡(luò)合物，氟離子濃度在一定范圍內(nèi)與該三元絡(luò)合物的吸光度成正比[26]。

1988 年朱碧英等[20]采用氟試劑比色法對南極磷蝦全蝦以及不同部位氟含量進行測定，研究結(jié)果表明氟在南極磷蝦體內(nèi)的富集特征為：蝦殼（包括甲殼和尾足）＞頭胸部＞肌肉，測定結(jié)果與Soevilk 選用氟離子電極法基本一致。由于南極磷蝦的高氟特性，樣品經(jīng)灰化蒸餾處理后，溶液中氟濃度超出國標GB/T5009.18-2003 檢測范圍，故趙彥玲等[28]從檢測波長、溜出液稀釋倍數(shù)等多方面對進行氟試劑比色法進行了優(yōu)化，研究確定了檢測最佳波長以及最佳稀釋倍數(shù)，從而減少試驗誤差。

3.3 離子色譜法

離子色譜法（ion chromatography，IC）是 20 世紀70年代發(fā)展起來的一種新的液相色譜技術(shù)，主要用于水溶液中無機態(tài)氟離子（F-）的含量測定。該法采用陰離子交換分離柱分離氟離子與其他離子成分，以碳酸鈉一碳酸氫鈉溶液為淋洗液，硫酸溶液為再生液，用電導(dǎo)檢測器對F-進行檢測[39]。該法具有準確度高、選擇性好、檢出限低、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于礦石、地表水、茶葉以及牙膏等物質(zhì)中氟含量測定[40-43]。

Zhao Y L 等[44]首次采用離子色譜法對南極磷蝦中氟含量進行測定，并對不同浸提方式（包括水浸提、硫酸蒸餾、鹽酸浸提以及鹽酸浸提液中加入總離子強度調(diào)節(jié)緩沖液劑）對于離子色譜測定F-的影響進行研究，研究結(jié)果表明，水浸提法僅能提取水溶性的F-，鹽酸浸提法中引入的大量氯離子對色譜分離柱傷害較大，鹽酸浸提法中加入總離子強度調(diào)節(jié)緩沖劑，不僅引入大量氯離子，且緩沖劑中的乙酸根離子與氟離子色譜峰重疊，而硫酸蒸餾法盡管引入了硫酸根離子，但氟離子與硫酸根離子保留時間相差較大，達到基線分離，故硫酸蒸餾更適用于南極磷蝦中氟化物的測定。Shen 等[27]采用1 mol/L 鹽酸溶液對冷凍干燥后南極磷蝦粉浸提，浸提1 h，浸提液中F-含量用離子色譜法進行測定，測得蝦中可溶性氟含量為（2 122.8±64.8）mg/kg，該法與Zhao 報道的方法相比，在進樣系統(tǒng)前增加了凈化程序（Ag+柱）以消除氯離子的干擾。

4 南極磷蝦產(chǎn)品中氟的檢測

南極磷蝦龐大的資源量是南極磷蝦商業(yè)化開發(fā)的最大動力，目前南極磷蝦產(chǎn)品較為普遍的產(chǎn)品存在形式有飼料級磷蝦粉、蝦油、酶解液[12-13]，因此這些產(chǎn)品中的氟含量的檢測同樣受到研究者的廣泛關(guān)注。

飼料級磷蝦粉富含氨基酸、磷脂、蝦青素、多不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料行業(yè)。Yoshitomi 等[45]采用氟試劑比色法對南極磷蝦粉喂養(yǎng)的虹鱒背部肌肉以及椎體內(nèi)氟離子含量進行測定，試驗結(jié)果表明隨著南極磷蝦粉喂養(yǎng)時間增加，虹鱒脊椎體內(nèi)氟化物含量增加，并對虹鱒的生長起到了抑制作用。Hansen 等[46]選擇氯化鈣作為鈣補充劑對降低虹鱒吸收磷蝦殼中氟化物進行研究，通過氟離子選擇電極法對虹鱒血漿中氟含量進行監(jiān)測。

蝦油富含二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等[47]物質(zhì)，是人體自身不能合成但又不可缺少的重要營養(yǎng)物，因此南極磷蝦油被廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)保健和制藥等行業(yè)。陰法文等[48]選用氯化鈣、氧化鈣、活性炭和活性粘土等作為吸收劑對南極磷蝦蝦油中的氟化物進行去除研究，氟離子去除率通過氟離子選擇性電極法來進行監(jiān)測。郭彤等[49]以乙醇、丙酮、正己烷為提取溶劑，采用離子色譜法對不同批次提取的蝦油以及油渣中的氟化物進行檢測分析，試驗結(jié)果表明乙醇提取的蝦油中氟的含量最低。

南極磷蝦酶解液是指南極磷蝦在生物酶的酶解作用下形成的富含短肽和氨基酸的酶解液，具有抗氧化、清除自由基、抑制有害菌、預(yù)防骨質(zhì)疏松的功能食品[50-52]。楊曉丹等[53]研究在竹炭中加Fe2（SO4）3溶液合成的改性竹炭對南極磷蝦酶解液中氟離子脫氟率，脫氟率通過氟離子選擇性電極法來進行測定。

5 結(jié)論及展望

目前，隨著對南極磷蝦資源的開發(fā)利用，科研工作者對南極磷蝦氟的形態(tài)分析和含量測定的不斷深入研究，南極磷蝦及其產(chǎn)品中氟的檢測方法得到重視。文中提到的測定南極磷蝦及其產(chǎn)品中氟的3 種方法均存在一定的缺點，不同方法所得到的分析數(shù)據(jù)在可靠性和可比性等方面仍存在不少問題，如何建立兼顧準確度和靈敏度的南極磷蝦氟前處理方法和儀器檢測技術(shù)，值得進一步研究。