不育男性抗苗勒管激素與生殖激素及精液質(zhì)量參數(shù)關(guān)系的研究

陳偉文，楊龍，吳榮海，黃黎明，陳振翅，黃昌平，徐煒，廖勇彬*

(江門市中心醫(yī)院1.泌尿外科；2.檢驗(yàn)科；3.生殖中心，江門 529030)

男性不育癥是一種發(fā)病率較高的男科疑難疾病。全球約5%～35%的家庭存在不孕不育問題，其中男方因素約占30%[1]。因此，必須加強(qiáng)男性不育的基礎(chǔ)及臨床研究?？姑缋展芗に?AMH) 是一種二聚體糖蛋白，由睪丸支持細(xì)胞分泌，以旁分泌作用于生精細(xì)胞，對(duì)生精細(xì)胞的成熟分化有著重要作用[2]。胎兒時(shí)期，AMH主要抑制苗勒管的發(fā)育并使中腎管發(fā)育為男性生殖管道[3-4]。目前AMH與性器官發(fā)育異常關(guān)系比較明確，與男性不育關(guān)系是近年研究的熱點(diǎn)。因此，本研究探討精漿和血清AMH與血清生殖激素及精液參數(shù)的關(guān)系，希望為精液異常所致的男性不育患者的治療提供參考及幫助。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2018年9～12月來我院生殖中心就診和咨詢的男性不育患者。常規(guī)詢問患者病史，記錄患者不育年限、身高、體重及睪丸總體積；行生殖系統(tǒng)體格檢查，測定患者的精液參數(shù)，檢測其精漿和血清中的AMH，同時(shí)檢測血清FSH、LH、PRL、T及E2。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有規(guī)律性生活的男性不育患者；(2)男性性功能正常，可以手淫取精者；(3)對(duì)本研究知情同意，能積極配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)染色體異常、接觸有毒、放射性物質(zhì)患者；(2)既往有隱睪、睪丸扭轉(zhuǎn)、睪丸腫瘤等手術(shù)史；(3)近3個(gè)月性激素或抗性激素治療及全身或生殖系統(tǒng)感染患者；(4)患有影響生育的疾病(如尿道下裂、輸精管異常、嚴(yán)重的精索靜脈曲張、隱睪癥、腫瘤等)。

本研究通過江門市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.樣本采集：男性在禁欲3～7 d后，于上午(8：00 am～10：00 am)靜脈抽血，血標(biāo)本送檢驗(yàn)科測定血清AMH、FSH、LH、PRL、T、E2?；颊咴谑孢m環(huán)境下使用手淫法采集精液，將精液射入干燥清潔廣口器皿，立即送至生殖中心實(shí)驗(yàn)室。稱重，37℃恒溫箱中充分液化，然后進(jìn)行精液常規(guī)及精子質(zhì)量相關(guān)參數(shù)分析。用一次性吸頭吸取1.5 ml精液，置于7 000 r/min離心機(jī)中離心3 min，取上層清液至干潔容器后進(jìn)行精漿激素AMH測定。

2.激素檢測方法：血清和精漿AMH采用AMH試劑盒(批號(hào)30151601，羅氏，美國),通過羅氏Cobas e602分析儀電化學(xué)發(fā)光法檢測；血清FSH、LH、PRL、T和E2采用西門子ADVIA centaur XP分析儀直接電化學(xué)發(fā)光法檢測，試劑盒均購自西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。所有激素項(xiàng)目測定嚴(yán)格按照說明書操作，激素靈敏度、最大濃度、批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)詳細(xì)見表1。

表1 激素檢測靈敏度、最大濃度、批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)

3. 精液參數(shù)分析：精液常規(guī)利用Sperm Class Analyzer(SCA)運(yùn)動(dòng)能力和濃度檢測模塊進(jìn)行圖像采集和精液分析，參照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第五版)》(以下簡稱《WHO-5》)判斷檢測結(jié)果，每一份標(biāo)本觀察10個(gè)視野。主要包括精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子(PR)百分比(%)等。精子形態(tài)分析根據(jù)《WHO-5》形態(tài)學(xué)嚴(yán)格判讀標(biāo)準(zhǔn)及操作程序，采用改良的巴氏染色方法，每次計(jì)數(shù)200條以上精子，計(jì)算精子正常形態(tài)率，讀片采用人工分析(技師已參加新版手冊(cè)專業(yè)培訓(xùn))；頂體酶采用WHO推薦的改良Kennedy法測定；精子DNA完整性采用吖啶橙染色法。檢測試劑盒均購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

4.分組：參照《WHO-5》標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)精液參數(shù)分為4組：少精子癥組(n=15)：精子濃度<15×106/ml，PR>32%；弱精子癥組(n=26)：精子濃度>15×106/ml，PR<32%；少弱精子組(n=31)：精子濃度<15×106/ml，PR<32%；正常精子組(n=35)：精子濃度>15×106/ml，PR>32%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況比較

共納入男性不育患者107例，年齡22～45歲。各組患者間年齡、禁欲天數(shù)、精液體積、不育年限、體重指數(shù)(BMI)、睪丸總體積等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 一般情況比較(-±s)

二、血清生殖激素水平比較

單因素方差分析顯示，不同組間血清FSH和T水平存在顯著性差異(P<0.05)，LH、PRL及E2水平則均無顯著性差異(P>0.05)。LSD法進(jìn)行多重比較提示，少弱精子組血清FSH水平顯著高于弱精子癥組、正常精子組(P<0.05)，而與少精子癥組無顯著性差異(P>0.05)，少精子癥組、弱精子癥組和正常精子組兩兩比較無顯著性差異(P>0.05)；正常精子組血清T水平顯著高于少精子癥組、弱精子癥組和少弱精子組(P<0.05)，少精子癥組、弱精子癥組和少弱精子組兩兩比較無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

三、血清和精漿AMH的結(jié)果分析比較

Kruskal-Wallis多重檢驗(yàn)顯示，精漿AMH水平組間差異顯著(P<0.05)，血清AMH水平則無顯著性差異(P>0.05)。正常精子組精漿AMH水平顯著高于少精子癥組、少弱精子組(P<0.05)，但與弱精子癥組無顯著性差異(P>0.05)，少精子癥組、弱精子癥組和少弱精子組兩兩比較無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表3 各組血清生殖激素水平比較[(-±s)]

注：采用單因素方差分析LSD法多重比較提示組間差異顯著，▲P<0.05；與少弱精子組比較*P<0.05；與正常精子組比較，#P<0.05

表4 各組血清和精漿AMH的比較[M(QR)]

注：采用Kruskal-Wallis多重檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，▲P<0.05；與正常精子組比較，*P<0.05

四、精漿AMH、血清AMH與血清生殖激素的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，血清AMH與精漿AMH無相關(guān)性(P>0.05)，與血清FSH、LH、PRL、T、E2亦無相關(guān)性(P>0.05)；精漿AMH與血清FSH、LH呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與血清T呈正相關(guān)(P<0.05)，與血清PRL、E2不相關(guān)(P>0.05)(表5)。

五、精漿AMH、血清AMH與精液參數(shù)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，血清AMH與精液參數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)；精漿AMH與精子濃度、精子總數(shù)、PR呈正相關(guān)(P<0.05)，與精液體積、正常精子形態(tài)率、頂體酶活性及精子DNA完整性不相關(guān)(P>0.05)(表6)。

表5 精漿AMH、血清AMH與血清生殖激素的相關(guān)性分析

注：Spearman相關(guān)性分析，*P<0.05

表6 精漿AMH、血清AMH與精液參數(shù)的相關(guān)性分析

注：Spearman相關(guān)性分析，*P<0.05

討 論

AMH能促進(jìn)具有分化成輸卵管、子宮和陰道上段潛能的男性胎兒苗勒氏管的退化[5]，是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員之一。在男性胎兒的第8周，睪丸的未成熟支持細(xì)胞開始表達(dá)分泌AMH，在男性性腺發(fā)育及性分化有重要的作用[4]。在未見睪丸的新生兒中，它常常用于鑒別患兒是無睪丸還是隱睪[5-6]。出生后3～12個(gè)月的嬰兒AMH處于最高水平[7]，這可能與支持細(xì)胞增殖活躍有關(guān)[8]；青春期前，由于睪丸支持細(xì)胞處于未成熟階段，體內(nèi)AMH保持較高水平，生精細(xì)胞停留在減數(shù)分裂前期。在青春期AMH下降到低水平并保持相對(duì)穩(wěn)定，這可能是由于睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步分化，開始大量分泌T，促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞成熟，使生精細(xì)胞進(jìn)入減少分裂，這時(shí)T對(duì)AMH的抑制大于FSH對(duì)其促進(jìn)作用，最終導(dǎo)致AMH表達(dá)迅速下調(diào)至嬰兒期的3%左右[7，9]。青春期后成年階段AMH維持在較低水平[10]。生育期AMH水平隨年齡的增長而下降[11]。

精子發(fā)生是一個(gè)激素依賴連續(xù)不斷增生和分化的過程，主要通過下丘腦-垂體-性腺軸實(shí)現(xiàn)。LH作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells，LCs)，促進(jìn)T的合成。FSH與睪丸支持細(xì)胞(Sertoli Cell，SCs)的FSH受體結(jié)合，與T共同調(diào)節(jié)精子的發(fā)生[12]。本研究顯示FSH與精漿AMH水平呈負(fù)相關(guān)，這可能在轉(zhuǎn)錄因子SOX9、SF1、GATA4以及NF-κB和AP2的作用下，F(xiàn)SH參與激活Gsα蛋白，影響腺苷酸環(huán)化酶和蛋白激酶A(PKA)活性進(jìn)而影響AMH水平[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)精漿AMH與LH呈負(fù)相關(guān)，因?yàn)锳MH可刺激LH脈沖分泌，AMH變動(dòng)可引起LH變動(dòng)[16]，也可能通過下丘腦-垂體-性腺軸引起LCs功能失常，導(dǎo)致T生成異常，最終不利于精子發(fā)生。本研究觀察到精漿AMH水平與血清T呈正相關(guān)，這可能是因?yàn)檠錋MH通過下丘腦中AMH受體的作用，參與到下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)[16]，而睪丸局部的AMH通過LCs上的AMH受體對(duì)其發(fā)揮一定的作用，影響到T的分泌，而T是維持精子發(fā)生所必需，通過細(xì)胞內(nèi)雄激素受體(Androgen receptor，AR)介導(dǎo)精子發(fā)生過程，在沒有T或缺乏功能性AR的環(huán)境下，精子發(fā)生減少，故AMH可通過影響T水平引起生精障礙。因此，AMH可激活Smad信號(hào)通路影響促性腺激素分泌，通過內(nèi)分泌激素相互作用最終影響生精過程。

SCs產(chǎn)生AMH并能夠雙向分泌AMH，頂端向生精小管管腔分泌，向基底分泌則進(jìn)入組織或血液循環(huán)，青春期后優(yōu)先向頂端分泌[9]。由于血睪屏障的存在，使得AMH等大分子物質(zhì)難以透過屏障而進(jìn)入血液循環(huán)。所以，男性血清AMH與精漿AMH不存在相關(guān)性，血清AMH不能很好地預(yù)測精子發(fā)生[17]，與精子質(zhì)量參數(shù)無相關(guān)關(guān)系(P>0.01)[17-19]，本研究也得出類似結(jié)果。此外，進(jìn)入循環(huán)的AMH又受到全身性血漿的稀釋作用。所以，精子發(fā)生過程中精漿AMH水平要明顯高于血漿AMH水平[9]。睪丸組織產(chǎn)生的激素隨著精液，通過射精由生殖道排出體外，其檢測便捷且無創(chuàng)傷。所以探究精漿激素水平，比血清能更好地反映睪丸組織微環(huán)境中真實(shí)的激素水平狀態(tài)，能更好地了解睪丸的生精狀況，對(duì)患者診治有著重要意義。

Andersen等[19]對(duì)94名來自普通人群的志愿者和32名不育男性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，精漿AMH與精子濃度、精子總數(shù)及PR精子百分率存在相關(guān)性(P<0.01)。本研究中，正常精子組的精漿AMH濃度顯著高于少精子癥組和少弱精子組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)精漿AMH與精子總數(shù)、精子濃度及前向運(yùn)動(dòng)呈正相關(guān)；與以往報(bào)道[17-19]結(jié)果相近。Majumdar等[20]通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMH對(duì)胚胎期及出生后小鼠精原細(xì)胞的發(fā)育有著重要作用。AMH可作用于SCs，并使其產(chǎn)生干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)，而SCF又是SCs發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。SCF通過激活PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而調(diào)節(jié)精原細(xì)胞的自我更新、增殖和分化。不同濃度的AMH對(duì)SCs產(chǎn)生不同效果。Anttonen等[21]使用不同濃度的rh-AMH去處理小鼠SCs，發(fā)現(xiàn)10～50 ng/ml低濃度的rh-AMH可通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促使SCs的增殖；然而50～800 ng/ml高濃度的rh-AMH，通過干擾細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使凋亡基因Caspase-3等表達(dá)上調(diào)和抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)，最終促進(jìn)了SCs的凋亡。另外，Rehman等[22]也發(fā)現(xiàn)低濃度的rh-AMH能夠激活絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族中非經(jīng)典ERK信號(hào)傳導(dǎo)路徑，增加SCF mRNA和SCF蛋白表達(dá)水平。有研究以重組人FSH治療特發(fā)性少弱畸精癥，發(fā)現(xiàn)治療有效患者的精漿AMH基線水平明顯高于無效組，治療后能提高患者AMH，暗示檢測精漿AMH能預(yù)測患者的藥物治療效果[23]。此外Nery等[24]研究認(rèn)為精漿AMH還有助于維持精子活力，可以作為評(píng)估弱精子癥患者冷凍后復(fù)蘇的精子質(zhì)量指標(biāo)之一。

因此，男性不育患者精漿AMH與部分精液參數(shù)存在一定的相關(guān)性。由于SCs在睪丸結(jié)構(gòu)上起到支持、屏障作用，在功能上起到免疫豁免，以及在精子保護(hù)、排出、營養(yǎng)供給方面都起到重要作用，而AMH由SCs產(chǎn)生，并反作用于SCs。在適宜的濃度范圍內(nèi)，隨著精漿AMH濃度的升高，精子濃度、PR%等精液參數(shù)會(huì)隨它升高而提高。所以，檢測精漿AMH能反映睪丸支持細(xì)胞數(shù)目及功能狀況，一定程度上反映患者睪丸的生精功能。但是，本研究課題僅限于單一中心研究，且樣本量較小、研究時(shí)間較短，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、多中心、基礎(chǔ)及臨床研究，探討精漿AMH與精子質(zhì)量的關(guān)系以及AMH在精子發(fā)生中的作用，從而制定合適的醫(yī)學(xué)參考值，指導(dǎo)男性不育診治工作。